本发明专利技术提供一种粪肠球菌间接血凝检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括粪肠球菌间接血凝抗原，所述粪肠球菌间接血凝抗原由粪肠球菌CCTCC M 2016027的全菌蛋白和醛化‑鞣酸化绵羊红细胞组成。本发明专利技术的试剂盒操作简单、方便快速，无需特殊设备和仪器，全程在2～3小时内完成，适合在基层推广应用，可广泛应用于粪肠球菌病流行病学的调查研究。检测结果重复性好，稳定，可靠，能够准确的检测粪肠球菌的抗体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于用于微生物的检测试剂
，具体涉及一种粪肠球菌间接血凝检测试剂盒及其应用。
技术介绍
粪肠球菌（Enterococcus faecalis）是革兰氏阳性，过氧化氢阴性球菌，是人和动物肠道内主要菌群之一。自20世纪80年代以来，粪肠球菌已逐渐成为人和动物重要的条件性致病菌，可引起菌血症、尿道感染、心内膜炎等疾病。目前，在动物疾病诊断方面，粪肠球菌感染主要依靠实验室细菌分离、PCR分子生物学鉴定，在基层则缺乏快速有效的粪肠球菌血清学诊断方法。血清学诊断方法的缺乏，可能使得基层对粪肠球菌感染造成误诊及漏诊，从而对畜牧业生产造成不必要的损失。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种粪肠球菌间接血凝检测试剂盒及其应用。本申请采用超声细胞破碎法提取粪肠球菌菌体抗原作为检测抗原，致敏醛化鞣酸化的绵羊红细胞，与粪肠球菌高免兔血清，粪肠球菌阳性血清进行间接血凝实验。结果显示该方法特异性好、灵敏度高，可为粪肠球菌病的血清学快速诊断及流行病学调查提供依据。本申请提供一种粪肠球菌间接血凝检测试剂盒，所述试剂盒包括粪肠球菌间接血凝抗原，所述粪肠球菌间接血凝抗原由粪肠球菌CCTCC M 2016027的全菌蛋白和醛化-鞣酸化绵羊红细胞组成。作为优选，所述粪肠球菌全菌蛋白的浓度为20μg/ml-40μg/ml。作为优选，所述粪肠球菌CCTCC M 2016027的全菌蛋白和醛化-鞣酸化绵羊红细胞的体积比为1:1。作为优选，所述试剂盒还包括标准阳性血清。作为优选，所述试剂盒还包括标准阴性血清。作为优选，所述试剂盒还包括稀释液。作为优选，所述粪肠球菌间接血凝抗原的制备方法为：（1）粪肠球菌菌体抗原的制备对粪肠球菌进行扩大培养，离心收获菌体后，洗涤，重悬，再于冰浴中以超声波间歇破碎10min，离心取上清，得到粪肠球菌菌体抗原悬浮液；（2）红细胞的固定和醛化-鞣酸化将保存于Alsever's 液中的公绵羊血在4℃静置3-7天后，按常规方法对绵羊红细胞进行洗涤、戊二醛固定和鞣酸处理，所用的溶液均为 pH 7.2浓度为0.15M的PBS，制备好的绵羊红细胞用 pH7.2浓度为0.15M的PBS悬浮至5%浓度，得到醛化-鞣酸化后的红细胞悬液；（3）粪肠球菌间接血凝抗原的制备以步骤（1）得到的粪肠球菌菌体抗原致敏步骤（2）得到的红细胞，得到粪肠球菌间接血凝抗原，粪肠球菌间接血凝抗原的终浓度为20μg/ml-40μg/ml。本专利技术还提供上述试剂盒在检测粪肠球菌中的应用，所述应用是非疾病的诊断和治疗目的的应用。作为优选，同时检测n（n≤9）个待测抗原的具体方法为：（1）在滴定板1-n列每列第1孔分别加入待检血清，第n+1、n+2、n+3分别加入同样体积的标准阳性血清、标准阴性血清和空白对照，将1-n+2列从第1孔开始进行4倍倍比稀释至最后一孔；（2）每孔加入粪肠球菌间接血凝抗原；（3）震荡滴定板，充分混匀，置37℃恒温箱1.5-2h；（4）根据红细胞凝集程度判定待检血清效价，以出现50%红细胞凝集的最大稀释倍数作为该份血清的抗体效价。本专利技术的优越性包括以下方面：（1）本专利技术中抗原为粪肠球菌菌体抗原，具有很强的特异性，能真实地检测粪肠球菌抗体；（2）用蛋白致敏醛化-鞣酸化绵羊红细胞，避免了新鲜绵羊红细胞保存时间短、致敏效价低的缺点，易于长时间保存，血凝效价高。（3）操作简单、方便快速，无需特殊设备和仪器，全程在2～3小时内完成，适合在基层推广应用，可广泛应用于粪肠球菌病流行病学的调查研究。（4）结果的重复性好，稳定，可靠，能够准确的检测粪肠球菌的抗体。（5）本专利技术是目前国内唯一的检测粪肠球菌抗体的诊断试剂，且价格低廉，安全稳定，无毒性，无环境污染。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。实施例1 粪肠球菌间接血凝诊断试剂盒的制备粪肠球菌间接血凝诊断试剂盒的组分如下：（1）粪肠球菌间接血凝抗原1瓶，10ml/瓶；（2）标准阳性血清1瓶，1ml/瓶；（3）标准阴性血清1瓶，1ml/瓶；（4）稀释液2瓶，10ml/瓶。该试剂盒的保存期为一年。1粪肠球菌间接血凝抗原的制备1.1培养基配制配制THB液体培养基2000ml：将牛肉粉4.0g，胰蛋白胨40g，葡萄糖40g，氯化钠6.0g，Na2HPO4 5.8g，KH2PO4 0.6g，Yeast extracts 6.0g加入去离子水，定容至2000mL，充分搅拌溶解，用无水Na2CO3调pH值至7.4。高温高压灭菌，待培养基放凉后，放入4℃保存备用。1.2 粪肠球菌菌体抗原制备将粪肠球菌Enterococcus faecalis 10zyl01 (由本实验室分离自青海民和县羊感染病料，将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2016027，保藏日期为2016年1月8日。单菌落分别接种于20ml THB液体培养基中，放置于37℃温箱中，培养10h左右后，根据麦氏比浊管估算菌液浓度约为4-5×108cfu时，然后吸取该20ml的菌液接种到新的0.5LTHB液体培养基，恒温37℃培养16h后收获菌液，8000 r/min离心30min收获菌体，沉淀物用0.15mol/L pH7.4 PBS悬浮，如上洗涤3次后，再按菌体体积50倍量加0.15mol/L pH7.4的PBS稀释至125 mL，配成浓缩抗原。冰浴中以超声波间歇破碎10min，然后4000 r/min离心20min，吸取上清液，再10000 r/min离心20min，离心后的上清浓缩液为抗原贮备液，加终浓度0.1g/L的硫柳汞，-20℃保存备用。1.3 红细胞的固定和醛化-鞣酸化将用等量的Alsever's 液保存的公绵羊血在4℃下经3-7天稳定后,离心洗涤，以3000rpm离心10分钟, 弃上清液。沉积的红细胞用10倍体积量的pH为7.2浓度为0.15M的PBS 按上述离心条件洗涤三次，在每5毫升红细胞加入pH 7.2浓度为0.15M的PBS 95 毫升, 使成体积浓度为5%红细胞悬液。将其置电磁搅拌器上搅拌，每100毫升5%红细胞悬液加入2.5%戊二醛20毫升，加定后在室温下继续搅拌1小时，以3000rpm离心3分钟, 弃上清液。再用pH 为7.2浓度为0.15M的PBS，以3000rpm离心3分钟的条件离心洗涤三次后, 加入新配制的2.5%鞣酸100毫升, 充分混合后置37℃水浴箱中10分钟, 离心弃上清液, 再以pH 7.2浓度为0.15M的PBS离心洗涤三次后, 再用pH为7.2浓度为0.15M的PBS配成5%醛化-鞣酸化红细胞悬液, 置4℃下保藏备用。1.4 粪肠球菌间接血凝抗原的制备（即粪肠球菌菌体抗原致敏醛化-鞣酸化绵羊红细胞的制备）将粪肠球菌菌体抗原稀释成200μg/ml，取1体积份粪肠球菌菌体抗原与1体积份5%醛化-鞣酸化绵羊红细胞混合均匀（致敏浓度为10μg/ml），在37℃水浴中作用30 min，其间不断搅拌；然后用pH 为7.2浓度为0.15 M的PBS以3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种粪肠球菌间接血凝检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括粪肠球菌间接血凝抗原，所述粪肠球菌间接血凝抗原由粪肠球菌CCTCC M 2016027的全菌蛋白和醛化‑鞣酸化绵羊红细胞组成。
【技术特征摘要】
1.一种粪肠球菌间接血凝检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括粪肠球菌间接血凝抗原，所述粪肠球菌间接血凝抗原由粪肠球菌CCTCC M 2016027的全菌蛋白和醛化-鞣酸化绵羊红细胞组成。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述粪肠球菌全菌蛋白的浓度为20μg/ml-40μg/ml。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述粪肠球菌CCTCC M 2016027的全菌蛋白和醛化-鞣酸化绵羊红细胞的体积比为1:1。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括标准阳性血清。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括标准阴性血清。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括稀释液。7.根据权利要求1-6任一所述的试剂盒，其特征在于：所述粪肠球菌间接血凝抗原的制备方法为：（1）粪肠球菌菌体抗原的制备对粪肠球菌进行扩大培养，离心收获菌体后，洗涤，重悬，再于冰浴中以超声波间歇破碎10min，离心取上清，得到粪肠球菌菌体抗原悬浮液；（2）红细胞的固定和醛化-鞣酸化将保存于Alsever's 液中的公绵羊血在4℃...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘永生，李学瑞，周建华，马丽娜，刘永安，王立燕，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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