本发明专利技术公开了一株能够高效转化延胡索酸为L‑天冬酰胺的重组大肠杆菌，将耐铵型大肠杆菌BEW308中编码富马酸酶的基因fumA、fumB、fumC失活，再将编码L‑天冬氨酸酶和L‑天冬酰胺酶编码基因插入到编码富马酸酶fumAC基因的位置，即得到无苹果酸副产、少量L‑天冬氨酸积累并主产L‑天冬酰胺的重组大肠杆菌。本发明专利技术还公开了上述菌株的构建方法及应用。本发明专利技术可实现L‑天冬氨酸酶和L‑天冬酰胺酶的组成型高活性表达，并最终实现延胡索酸至L‑天冬酰胺的转化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一株转化延胡索酸合成L-天冬酰胺生产菌株及其构建方法与应用。
技术介绍
L-天冬酰胺是L-天冬氨酸的羟基酰胺化合物，在医药、食品、轻化工和水环保方面具有广泛的用途，在医药行业主要作为氨基酸输液中的二十种之一，并具有治疗皮肤病的功效。在食品行业只要作为营养增补剂，抗酒精中毒剂，也可进一步衍生做香味剂。在化工行业主要做铁盐的稳定剂及陶瓷表面的薄膜。在环保行业是水处理膜的重要原料。目前L-天冬酰胺的生产主要以L-天冬氨酸为原料经酯化氨解，精制而成，但其过程产物收率偏低，且涉及大量的有机溶剂，污染大，废水难处理。生物法具有反应温和、转化率高、三废易处理等优点，是L-天冬酰胺最佳的生产方式，但L-天冬氨酸转化为L-天冬酰胺过程中涉及到辅酶的参与，因此需要解决辅酶的供给问题，本专利技术基于此构建了具有高效转化合成L-天冬酰胺的菌株，并建立了其发酵工艺，生产指标具有显著的经济性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，提供一株利用延胡索酸合成L-天冬酰胺的重组大肠杆菌。本专利技术还要解决的技术问题是，提供上述能够高效转化延胡索酸合成L-天冬酰胺重组大肠杆菌在制备L-天冬酰胺中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一株高效转化延胡索酸为-天冬酰胺的重组大肠杆菌，将耐铵型大肠杆菌BEW308中编码富马酸酶的基因fumA、fumB、fumC失活，再将编码L-天冬氨酸酶基因和编码L-天冬酰氨酶基因插入到编码富马酸酶的fumAC基因位置，即得高效转化延胡索酸为-天冬酰胺的重组大肠杆菌。所述的耐铵型大肠杆菌BEW308，该菌株的保藏号为CCTCC NO：M2013157，该菌株的详细信息已经在申请号为201310279778.6的中国专利中公开。其中，所述编码L-天冬氨酸酶的基因序列如SEQ ID NO：1所示，所述编码L-天冬酰胺酶的基因序列如SEQ ID NO：2所示。其中，L-天冬氨酸酶基因的起始密码子上游有一段信号肽，该信号肽的基因序列如SEQ ID NO：3所示，将L-天冬氨酸酶基因的终止密码子删除，在L-天冬氨酸酶基因的末端与L-天冬酰氨酶基因之间有一段连接序列，该连接序列如SEQ ID NO：4所示。上述高效转化延胡索酸为天冬酰胺的重组大肠杆菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将pKD46质粒转入耐铵型大肠杆菌BEW308中，筛选出阳性转化子大肠杆菌BEW308-pKD46，利用L-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将大肠杆菌BEW308-pKD46制备成感受态细胞；(2)以pIJ773质粒为模板，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的序列为引物，PCR扩增得到fumB基因敲除片段；(3)将步骤(2)得到的fumB基因敲除片段电转化至大肠杆菌BEW308-pKD46制备成感受态细胞中，在安普抗性平板上筛选阳性重组子；(4)将步骤(3)得到的阳性重组子制备成感受态细胞，将pCP20质粒转化其中，42℃诱导FLP重组酶表达，在安普霉素抗性平板和无抗性的平板上进行双挑实验，在物抗性的平板上生长，但不能在有安普霉素抗性的平板上生长的菌株为fumB基因失活的菌株BEW308-ΔfumB；(5)合成同源重组片段：在SEQ ID NO：1起始密码子ATG前增加信号肽序列SEQ ID NO：3，删除L-天冬氨酸酶基因的终止密码子，并在L-天冬氨酸酶基因后添加连接序列SEQ ID NO：4，该片段还包括安普霉素抗性基因序列，并在该片段的两端添加了fumAC的同源臂，具体序列如SEQ ID NO：7所示；(6)将步骤(4)得到的fumB基因失活的菌株BEW308-ΔfumB制备成感受态细胞，将pKD46质粒转化其中，利用L-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将其制备成感受态细胞；(7)将步骤(5)中的同源重组片段转化至步骤(6)的含有λ重组酶的感受态细胞中，在安普抗性平板上筛选阳性重组子；(8)将步骤(7)中的阳性重组子制备成感受态细胞，将pCP20质粒转化其中，42℃诱导FLP重组酶表达，在安普霉素抗性平板和无抗性的平板上进行双挑实验，在无抗性的平板上生长，但不能在有安普霉素抗性的平板上生长的菌株即为能够高效转化延胡索酸为天冬酰胺的重组大肠杆菌BEW308ΔfumB-△fumAC-aspC2-30-asnA。上述转化延胡索酸为-天冬酰胺的重组大肠杆菌在生产L-天冬酰胺中的应用。其中，其发酵过程分为诱导阶段和转化阶段。其中，诱导阶段培养基配方为：延胡索酸20g/L，酵母粉24g/L，蛋白胨10g/L，K2HPO436mmol/L，MgSO4 10mmol/L，微量元素[CaCl2.6H2O 0.74g/L，ZnSO4.7H2O 0.18g/L，MnSO4.H2O 20g/L，Na2-EDTA20.1g/L，CuSO4 0.1g/L，CoCl2 0.104g/L,FeSO4.7H2O2g/L]2mL/L，溶剂为水，pH为7.2～7.5。转化阶段补料发酵：诱导阶段结束后分次补加总计葡萄糖40～60g/L，延胡索酸150～200g/L。其中，诱导阶段温度为28～30℃，pH为7.2～7.8，溶氧为5～40％；转化阶段温度为30～37℃，pH为7.2～7.8，溶氧为5～40％。其中，葡萄糖补加方式为将葡萄糖配置成600g/L的储液，并根据发酵液体积分两次补加，总计40～60g/L；延胡索酸的补加方式为配成400g/L的延胡索酸混悬液，并用氨水调节pH至中性，分5次补加总计约150～200g/L的延胡索酸。有益效果：(1)本专利技术可实现L-天冬氨酸酶和L-天冬酰胺酶的组成型高活性表达，且发酵培养后获得的细胞具有低富马酸酶活性。(2)通过诱导-转化两阶段发酵过程，其转化产物中主要是L-天冬酰胺(底物的摩尔转化率超过97.5％)，有少量L-天冬氨酸积累，无苹果酸积累。该方法可有效提高底物延胡索酸的转化收率，降低副产物的生产，有效降低生产成本。附图说明图1敲除fumB基因的线性片段PCR图，泳道M为marker，泳道1为线性片段。图2菌落PCR鉴定图，其中BEW308泳道为出发菌株，M为Marker，1～8为鉴定的单菌落。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。实施例1：本实施例说明利用同源重组技术敲除亲本耐铵型大肠杆菌BEW308中富马酸酶fumB基因，得到消除安普霉素抗性菌株的过程。(1)利用LB培养基，于37℃、有氧条件下培养大肠杆菌BEW308至OD600＝0.4～0.6，制备成电转感受态；(2)将pKD46质粒电转入感受态的大肠杆菌BEW308。电击条件为：200Ω，25μF，电击电压2.3kv，电击时间4～5ms。电击后迅速将菌体加入预冷1mL的SOC培养基，150r/min、30℃培养1h之后涂布于带氨苄青霉素(amp)的LB培养基平板筛选出阳性转化子BEW308(pKD46)；(3)在LB培养基中加入10mM的L-阿拉伯糖，于30℃下诱导质粒pKD46表达出λ重组酶，制成电转感受态；(4)以两侧带有本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株高效转化延胡索酸为天冬酰胺的重组大肠杆菌，其特征在于，将耐铵型大肠杆菌BEW308中编码富马酸酶的fumA、fumB、fumC基因失活，再将编码L‑天冬氨酸酶的基因和编码L‑天冬酰氨酶的基因插入到编码富马酸酶的fumAC基因位置，即得高效转化延胡索酸为‑天冬酰胺的重组大肠杆菌。
【技术特征摘要】
1.一株高效转化延胡索酸为天冬酰胺的重组大肠杆菌，其特征在于，将耐铵型大肠杆菌BEW308中编码富马酸酶的fumA、fumB、fumC基因失活，再将编码L-天冬氨酸酶的基因和编码L-天冬酰氨酶的基因插入到编码富马酸酶的fumAC基因位置，即得高效转化延胡索酸为-天冬酰胺的重组大肠杆菌。2.根据权利要求1所述的高效转化延胡索酸为天冬酰胺的重组大肠杆菌，其特征在于，编码L-天冬氨酸酶的基因序列如SEQ ID NO：1所示，编码L-天冬酰胺酶的基因序列如SEQ ID NO：2所示。3.根据权利要求1所述的高效转化延胡索酸为天冬酰胺的重组大肠杆菌，其特征在于，编码L-天冬氨酸酶的基因的起始密码子上游有一段信号肽，该信号肽的基因序列如SEQ ID NO：3所示，将L-天冬氨酸酶基因的终止密码子删除，在L-天冬氨酸酶基因的末端与L-天冬酰氨酶基因之间有一段插入连接序列，该连接序列如SEQ ID NO：4所示。4.权利要求1所述的高效转化延胡索酸为天冬酰胺的重组大肠杆菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将pKD46质粒转入耐铵型大肠杆菌BEW308中，筛选出阳性转化子大肠杆菌BEW308-pKD46，利用L-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将大肠杆菌BEW308-pKD46制备成感受态细胞；(2)以pIJ773质粒为模板，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的序列为引物，PCR扩增得到fumB基因敲除片段；(3)将步骤(2)得到的fumB基因敲除片段电转化至大肠杆菌BEW308-pKD46制备成感受态细胞中，在安普抗性平板上筛选阳性重组子；(4)将步骤(3)得到的阳性重组子制备成感受态细胞，将pCP20质粒转化其中，42℃诱导FLP重组酶表达，在安普霉素抗性平板和无抗性的平板上进行双挑实验，在物抗性的平板上生长，但不能在有安普霉素抗性的平板上生长的菌株为fumB基因失活的菌株BEW308-△fumB；(5)合成同源重组片段：在SEQ ID NO：1起始密码子ATG前增加信号肽序列SEQ ID NO：3，删除L-天冬氨酸酶基因的终止密码子，并在L-天冬氨酸酶基因后添加连接序列SEQ ID NO：4，该片段还包括安普霉素抗性基因序列，并在该片段的两...
【专利技术属性】
技术研发人员：马江锋，姜岷，董维亮，章文明，陈可泉，吴昊，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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