本发明专利技术公开了抑制人PARD6A基因表达的小干扰核糖核酸序列及其抗卵巢癌增殖和转移的用途，属于靶向基因药物研发与细胞生物学技术领域。这两对siRNA均能够在卵巢癌细胞株中与PARD6A基因的mRNA结合，有效的干扰它的转录后翻译，从而抑制细胞的增殖活性及吸附能力，达到控制卵巢癌细胞生长和转移及治疗卵巢癌的目的。本发明专利技术的两对siRNA有望用于制备高效、特异性、副作用小的抗卵巢癌药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学和生物医药领域，具体涉及沉默分离缺陷蛋白6家族细胞极性调节因子阿尔法的编码基因(Par-6Family Cell Polarity Regulator Alpha,PARD6A)的小干扰核糖核酸(Small interfering RNA,siRNA)序列及其在抑制卵巢癌生长、增殖和转移等方面的用途。
技术介绍
卵巢癌是发生于卵巢组织的恶性肿瘤，其发病率在女性生殖恶性肿瘤中位居第二，且其死亡率在妇科肿瘤中高居榜首,是妇科恶性肿瘤中最致命的一种。根据2012年全球癌症数据统计，在全球范围内，每年约有20万人被诊断为卵巢癌，12.5万人死于此病。由于卵巢深居盆腔，早期症状很不明显，患者难以察觉，同时又缺乏有效的普查和早期诊断方法，70％～80％患者就诊时已经处于中晚期，病灶通常不再仅仅局限于卵巢，而是扩散到了腹腔其它器官，治疗效果及预后均极差，5年生存率低于20％。卵巢癌因病理类型不同而治疗方案不同，但传统治疗手段一般用手术治疗联合化疗等进行综合治疗，但治疗效果并不尽如人意，且大多数病人的卵巢癌都会复发，而复发的卵巢癌大都对多种化疗药物产生抗性，故而缺乏有效的治疗方法和手段，寻求新的方法已成为该领域亟待解决的重要课题。大量的研究发现卵巢癌的高发病率和高死亡率的主要原因是恶性肿瘤的无限增殖和转移，因此寻找能够有效抑制卵巢癌细胞增殖和转移的方法，是提高卵巢癌患者生存率的关键。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，近年来该技术已被广泛用于探索基因功能及恶性肿瘤的基因治疗领域。分离缺陷蛋白6阿尔法(PAR6α，编码基因PARD6A)属于分离缺陷蛋白6(PAR6)家族，是一种重要的细胞极性蛋白，位于细胞前角质或上皮角质。目前研究表明，PAR6α蛋白在细胞极性的控制、细胞间紧密连接的形成、细胞不对称分裂、上皮间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)及肿瘤发生与进展等一系列生理与病理学过程中起关键作用。如在肿瘤的发生过程中，PAR6α蛋白可通过转化生长因子-β(TGFβ)在丝氨酸345上依赖的磷酸化，导致Smad泛素化调节因子1(Smad ubiquitination regulatory factor 1,Smurf1)介导的大鼠肉瘤蛋白RAS同源家族成员A蛋白(RhoA蛋白)降解，从而引起EMT现象；或被α蛋白激酶C(αPKC)磷酸化，通过表皮生长因子受体2(ErbB2)激活，与ErbB2受体和αPKC形成复合物，最终导致EMT以及肿瘤的发生。与此同时，也有文献指出以siRNA干扰PARD6A基因的表达，以及过量表达Smurf1和RhoA会阻碍EMT过程，进而达到抑制肿瘤生长的作用。到目前为止，PAR6α蛋白主要是作为细胞极化和细胞不对称分裂的一个重要的分子支架蛋白来研究，但是也有少量文章显示了PAR6α的表达影响着某些肿瘤细胞的增殖、吸附、细胞的极化和不对称分裂等。肿瘤细胞的增殖能力直接影响肿瘤的大小；吸附能力在肿瘤的转移中起重要作用：包括从其原发灶的解吸附开始转移与借从连续的粘附基质和解除粘附中获得移动的牵引力移动；而细胞的极化对细胞分化、细胞迁移、细胞质分裂、以及组织器官的形成等众多生物学过程起着关键性的作用。因此，PAR6α有望成为包括卵巢癌在内的多种恶性肿瘤的基因治疗靶点。但是目前还没有应用RNA干扰技术，以小分子RNA为靶向药物，有针对性地对PARD6A基因的转录后表达进行干扰，从而达到抑制卵巢癌细胞增殖和转移效果的专利发表。
技术实现思路
本专利技术通过用设计、实验筛选出的两对siRNA(分别以PAR1，PAR2命名)沉默PARD6A基因，验证其对人卵巢癌细胞株A2780的细胞增殖活性、吸附能力的影响，来判断沉默PARD6A基因的siRNA序列的特异性、靶向性，并验证其在抑制卵巢癌生长、增殖和转移等方面的用途。抑制人PARD6A基因表达的小干扰核糖核酸序列，为下列两种序列中的任意一种或一种以上：PAR1：5′-CCAACAGCCAUAACCUCAUTT-3′/5′-AUGAGGUUAUGGCUGUUGGTT-3′PAR2：5′-GGGCUUCUACAUCCGAGAUTT-3′/5′-AUCUCGGAUGUAGAAGCCCTT-3′上述的抑制人PARD6A基因表达的小干扰核糖核酸序列的用途，可有效地沉默卵巢癌细胞中的PARD6A基因，使该基因mRNA和蛋白质表达显著降低，从而达到治疗卵巢癌的目的。上述的抑制人PARD6A基因表达的小干扰核糖核酸序列的用途，,其特征在于可有效地抑制卵巢癌细胞的增殖活性及吸附能力。上述的抑制人PARD6A基因表达的小干扰核糖核酸序列的用途，用于制备抑制卵巢癌细胞生长和肿瘤转移的药物。通过细胞增殖实验表明PAR1和PAR2干扰PARD6A基因的表达后可显著抑制卵巢癌A2780细胞的增殖活性；吸附实验表明这两对siRNA均能抑制A2780细胞的吸附能力。从而证明通过利用设计筛选的两对siRNA通过抑制PARD6A基因的表达，可对卵巢癌细胞株A2780的增殖、吸附产生显著影响，进而抑制肿瘤的生长和转移。因此，应用RNAi技术，以小干扰RNA(siRNA)为靶向药物，有针对性地对PARD6A基因的转录后表达进行干扰，在今后的卵巢癌治疗研究中的具有潜在应用价值。本专利技术的有益效果本专利技术针对PARD6A基因设计了一系列siRNA序列，经脂质体逆转染使各对siRNA进入人卵巢癌细胞株A2780，以逆转染siGL2(与目的基因的序列无同源性)的A2780细胞为阴性对照，通过实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)实验来验证靶基因PARD6A的沉默效率并筛选出两对能高效干扰PARD6A基因的表达的siRNA，并通过蛋白免疫印迹(western blotting)实验进一步对筛选出的两对siRNA的沉默效果进行验证。接下来，再通过细胞活性检测实验和吸附实验，来检验本专利技术中的两对siRNA通过干扰PARD6A基因的表
达以抑制A2780细胞的增殖活性和吸附能力的效果。最终证明，本专利技术提供的两种siRNA序列，能有效地抑制PARD6A基因的表达，达到抑制卵巢癌细胞株A2780增殖和吸附活性的效果，从而抑制卵巢癌细胞的增殖和转移，在未来卵巢癌靶向治疗中具有非常大的潜在价值。附图说明：图1为qRT-PCR技术检测siPARD6A对PARD6A基因的信使RNA(mRNA)水平的抑制。图为实验组1-6(分别逆转染PAR1、PAR2、PAR3、PAR4、PAR5、PAR6)与对照组(逆转染siGL2)相比，PARD6A基因信使RNA(mRNA)表达的相对值。与对照组相比，PAR1和PAR2显著抑制PARD6A基因mRNA水平的表达，(**表示P<0.01，试验次数≥3)。图2为代表性Western blotting检测siPARD6A对PARD6A蛋白水平的抑制。对照组逆转染的是siGL2；实验组1和实验组2逆转染的分别为PAR1、PAR2。图3为P本文档来自技高网...
【技术保护点】
干扰PARD6A基因表达的siRNA序列，其特征是序列为下列两种序列中的任意一种或一种以上：PAR1：5´‑ CCAACAGCCAUAACCUCAUTT ‑3´/5´‑ AUGAGGUUAUGGCUGUUGGTT ‑3´PAR2：5´‑ GGGCUUCUACAUCCGAGAUTT ‑3´/5´‑ AUCUCGGAUGUAGAAGCCCTT ‑3´。
【技术特征摘要】
1.干扰PARD6A基因表达的siRNA序列，其特征是序列为下列两种序列中的任意一种或一种以上：PAR1：5´- CCAACAGCCAUAACCUCAUTT -3´/5´- AUGAGGUUAUGGCUGUUGGTT -3´PAR2：5´- GGGCUUCUACAUCCGAGAUTT -3´/5´- AUCUCGGAUGUAGAAGCCCTT -3´。2.权利要求1所述的干扰PARD6A基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘晗青，阮玲玲，张佩珊，尚东胜，赵志聪，屠志刚，刘莉，鲁永金，卢子文，沈艳婷，吴燕芳，张雅菲，梁智全，沈明香，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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