靶向HSP70基因RNA干扰重组慢病毒载体及其构建方法技术

本发明专利技术涉及靶向HSP70基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建、筛选及其用途。本发明专利技术利用RNA干扰技术，针对HSP70基因的不同靶序列，构建了四个能在293细胞中表达siRNA的慢病毒真核表达载体，干扰慢病毒是由pLv‑HSP70shRNA、pMD2.G和pSPAX2载体共转染293T细胞培养获得。本发明专利技术靶向HSP70基因RNA干扰重组慢病毒载体能高效特异性的抑制HSP70基因表达，可用于制备治疗帕金森病或肿瘤相关性基因药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及靶向热休克蛋白70（heat shock protein 70, HSP70）基因的RNA干扰重组慢病毒载体及其构建，属于生物医药

技术介绍
热休克蛋白（heat shock protein , HSP）又称应激蛋白，是一类广泛存在于各种生物体内的进化上高度保守的细胞应激蛋白。HSP70是HSP 家族中最保守、最主要、含量最丰富的一种，也是迄今为止研究较多的一种。细胞在受热或其他不良因素刺激下发生应激反应可诱导产生HSP，参与细胞内各种新生肽链的结合、装配及跨膜转运。主要作为一种分子伴侣的作用出现，常常在不同的环境和病理刺激下产生。其保护细胞的功能主要是通过促进新生肽的折叠以及去除变性的蛋白。在各种肿瘤细胞中，HSP70通过抑制凋亡和促进肿瘤细胞的增值，导致肿瘤细胞的存活和增殖活性增加。研究提示，HSP70表达的增高与这些肿瘤细胞的增殖，侵犯，转移以及预后明显相关。帕金森病典型的病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元内包涵体( inclusion body)-路易体( Lewy body，LB)形成，包涵体内聚集了许多异常折叠的蛋白质，包括α-synuclein、泛素、氧化硝化蛋白等。目前发现几乎所有的神经变性疾病都以蛋白质聚集物为病理特征，这类具有毒性的蛋白质聚集反应，最终导致神经细胞缺失和神经元功能丧失。有学者把帕金森以及许多神经变性疾病看作为“蛋白质构象病”，是指由于正常生理功能的蛋白质发生构象改变而异常聚集所致，如果能够抑制或逆转此病理过程，挽救错误折叠的蛋白质，或许能够防治和缓解这类变性疾病。热休克蛋白由于其具有促使异常蛋白质重新折叠成天然结构而被泛素蛋白酶体系统降解的作用，对其功能的研究日益受到重视。RNA干扰技术能特异性降解mRNA，沉默靶基因，在转录后水平抑制基因的表达，从而可用来进行基因功能的研究和药物靶标的研究。RNA干扰机制研究表明，双链RNA分子首先被细胞内RNA酶Dicer降解成21-23个碱基大小的小分子干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）。siRNA被认为是RNA干扰的主要效应物。慢病毒载体作为常用的病毒载体之一，其特点是免疫原性低，能感染分裂相和非分裂相细胞，能自身携带片段整合入宿主细胞基因组，并在哺乳动物各类细胞稳定表达siRNA,长期抑制基因表达。
技术实现思路
本专利技术提供一种靶向HSP70基因的RNA干扰重组病毒载体构建、筛选及其用途。本专利技术以RNA干扰技术为主，针对HSP70基因的不同靶序列，构建了四个能在293T细胞中表达siRNA的慢病毒真核表达载体pLv-HSP70shRNA，该载体是自身失活的慢病毒载体，其示意图谱见图1，能特异性的抑制HSP70基因表达。本专利技术的技术方案如下：一种靶向HSP70基因的siRNA重组慢病毒表达载体，是用于帕金森病或肿瘤HSP70基因相关性治疗性物质，慢病毒是由pLv-HSP70shRNA、pMD2.G和pSPAX2载体共转染293T细胞培养获得；其中，所述的pLv-HSP70shRNA重组载体是在plv-shRNA载体的多克隆位点中连接双链DNA片段构建而得，酶切位点是BamHI和EcoRI，所述的双链DNA片段为以下序列中的一种：(1)HSP70-homo-S1寡核苷酸序列1:正义链:5’GATCC ccACCATTGAGGAGGTAGATT CTCGAG AATCTACCTCCTCAATGGTGG TTTTTg3’反义链:5’aattcaaaaaccACCATTGAGGAGGTAGATTCTCGAGAATCTACCTCCTCAATGGTGGG3’(2) HSP70-homo-S2寡核苷酸序列2:正义链: GATCCgcCATGACGAAAGACAACAATCTCGAGATTGTTGTCTTTCGTCATGGC TTTTTg反义链: AATTCAAAAAGCCATGACGAAAGACAACAATCTCGAGATTGTTGTCTTTCGTCATGGCG(3)HSP70-homo-S3寡核苷酸序列3:正义链: GATCCcgTGGAGGAGTTCAAGAGAAACTCGAGTTTCTCTTGAACTCCTCCACG TTTTTg反义链: AATTCAAAAACGTGGAGGAGTTCAAGAGAAACTCGAGTTTCTCTTGAACTCCTCCACGG(4)HSP70-homo-S4寡核苷酸序列4:正义链:GATCCgcTGACCAAGATGAAGGAGATCTCGAGATCTCCTTCATCTTGGTCAGC TTTTTg反义链: AATTCAAAAAGCTGACCAAGATGAAGGAGATCTCGAGATCTCCTTCATCTTGGTCAGCG。根据本专利技术，所述的靶向HSP70基因的siRNA重组慢病毒表达载体的构建方法，包括步骤如下：a.根据HSP70 mRNA序列，设计合成双链DNA片段，所述的双链DNA片段为所述的HSP70-homo-S1、HSP70-homo-S2、HSP70-homo-S3及HSP70-homo-S4核酸序列中的一种；b.然后将所述的双链DNA片段连接到plv-shRNA载体的多克隆位点中构建成pLv-HSP70shRNA重组载体;c.再将所述的pLv-HSP70shRNA重组载体与pMD2.G和pSPAX2载体共转染293T细胞培养，得靶向HSP70基因RNA干扰的重组慢病毒载体系统。为了对靶向HSP70基因RNA干扰的重组慢病毒载体对HSP70基因的抑制效果进行鉴定，将pLv-HSP70shRNA与包装质粒共转染293T细胞后进行荧光定量PCR检测目的基因表达水平，筛选出有效干扰质粒。附图说明图1为实施例中慢病毒表达载体plv-shRNA结果示意图。图2 HSP70干扰RNA慢病毒载体瞬转293T细胞48h图片(荧光、可见光)。其中(a)为普通光镜(100×)；(b)为荧光光镜(100×)。图3不同干扰序列下的HSP70表达水平。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。主要材料：293T细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所；大肠杆菌感受态DH5α购自北京全式金生物技术有限公司；慢病毒载体plv-shRNA购自Clontech公司，含有人U6启动子，编码绿色荧光蛋白报告基因；各种限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶及Taq DNA聚合酶均为美国NEB公司产品；SYBR Green I q RT-PCR Mixs购与上海生工生物工程技术服务公司；胎牛血清及DMEM培养液购自美国Gibico公司。实施例1 靶向HSP70基因的慢病毒载体构建1.寡聚核酸的设计与合成设计靶向HSP70基因（NM_005345.5）的4个干扰序列（表1），并合成相应的单链DNA表1靶向 HSP70基因RNA干扰序列序列名称序列信息 起始位置 S1ACCATTGAGGAGGTAGATT 2101 S2CATGACGAAAGACAACAAT 1539本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向HSP70基因的siRNA重组慢病毒表达载体，是用于帕金森病或肿瘤HSP70基因相关治疗性物质，干扰慢病毒是由pLv‑HSP70shRNA、pMD2.G和pSPAX2载体共转染293T细胞培养获得；其中，所述的pLv‑HSP70shRNA重组载体是在pLv‑shRNA载体的多克隆位点中连接双链DNA片段构建而得，酶切位点是BamHI和EcoRI；所述的双链DNA片段为以下序列中的一种：(1)HSP70‑homo‑S1寡核苷酸序列1:正义链:5’GATCCccACCATTGAGGAGGTAGATTCTCGAGAATCTACCTCCTCAATGGTGG TTTTTg3’反义链:5’aattcaaaaaccACCATTGAGGAGGTAGATT CTCGAG AATCTACCTCCTCAATGGTGGG3’(2) HSP70‑homo‑S2寡核苷酸序列2:正义链: GATCCgcCATGACGAAAGACAACAATCTCGAGATTGTTGTCTTTCGTCATGGC TTTTTg反义链: AATTCAAAAAGCCATGACGAAAGACAACAATCTCGAGATTGTTGTCTTTCGTCATGCG(3)HSP70‑homo‑S3寡核苷酸序列3:正义链: GATCCcgTGGAGGAGTTCAAGAGAAACTCGAGTTTCTCTTGAACTCCTCCACG TTTTTg反义链: AATTCAAAAACGTGGAGGAGTTCAAGAGAAACTCGAGTTTCTCTTGAACTCCTCCACGG(4)HSP70‑homo‑S4寡核苷酸序列4:正义链:GATCCgcTGACCAAGATGAAGGAGATCTCGAGATCTCCTTCATCTTGGTCAGC TTTTTg反义链: AATTCAAAAAGCTGACCAAGATGAAGGAGATCTCGAGATCTCCTTCATCTTGGTCAGCG。...

【技术特征摘要】
1.一种靶向HSP70基因的siRNA重组慢病毒表达载体，是用于帕金森病或肿瘤HSP70基因相关治疗性物质，干扰慢病毒是由pLv-HSP70shRNA、pMD2.G和pSPAX2载体共转染293T细胞培养获得；其中，所述的pLv-HSP70shRNA重组载体是在pLv-shRNA载体的多克隆位点中连接双链DNA片段构建而得，酶切位点是BamHI和EcoRI；所述的双链DNA片段为以下序列中的一种：(1)HSP70-homo-S1寡核苷酸序列1:正义链:5’GATCCccACCATTGAGGAGGTAGATTCTCGAGAATCTACCTCCTCAATGGTGG TTTTTg3’反义链:5’aattcaaaaaccACCATTGAGGAGGTAGATT CTCGAG AATCTACCTCCTCAATGGTGGG3’(2) HSP70-homo-S2寡核苷酸序列2:正义链: GATCCgcCATGACGAAAGACAACAATCTCGAGATTGTTGTCTTTCGTCATGGC TTTTTg反义链: AATTCAAAAAGCCATGACGAAAGACAACAATCTCGAGATTGTTGTCTTTCGTCATGCG(3)HSP70-homo-S3寡核苷酸序列3:正义链: GATCCcgTGGAGGAGTTCAAGAGAAACTCGAGTTTCTCTTGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭佳，蒋明，尹衍新，于丽华，蒋韵，王玏，
申请(专利权)人：同济大学苏州研究院，
类型：发明
国别省市：江苏;32