膜测定方法技术

本发明专利技术涉及膜测定方法。本发明专利技术提供含有细胞的身体样品的测定方法，所述方法包含在导致细胞裂解的条件下，优选地通过去污剂的方式，处理所述样品；并将产生的裂解样品置于导致核酸分子断裂的条件下。本发明专利技术还提供核酸断裂条件在增强膜测定中的用途，完成测定的装置和用于该测定的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请号为200680040755.8，申请日为2006年10月31日，专利技术名称为“膜测定方法”的中国专利申请的分案申请。
本专利技术涉及提高对身体样品测定的准确性、可靠性和/或速度的方法。具体地，本专利技术涉及使用具有小孔径(例如小于1μm)的膜或滤器进行的高速测定，特别是含细胞或细胞碎片的样品。最特别地，本专利技术涉及提高裂解(例如去污剂裂解)介导的膜浓缩测定的方法和相应的测定试剂盒和装置。
技术介绍
快速诊断测定对在即时检验(point-of-care)(PoC-例如在同医学专业人员商讨的时间)或在小型的或快速转变的医学诊断实验室中的用途的重要性日益增加。这样的试验，特别是对PoC用途，典型地使用至少一个含有用于接受样品的容积和允许样品同所述装置的部分相互作用的液体途径的“装置”，例如一次性的管、条、筒、圆筒等，和/或进一步的试剂。具有相对小的孔径，典型地0.2-5μm的膜，例如硝酸纤维素是快速诊断测定(例如免疫测定法)普遍使用的组分。这样的膜可能用做测定的固体相，也用于收集微小颗粒和沉淀的生物物质。存在两类能用于快速测定含有细胞的样品中的组分含量的普遍方法，例如血中的血浆蛋白的测定；人们能从液体(如血浆)分离细胞或裂解所述细胞使其穿过膜。在分离方法中，在分析前，分离过程中或通过使用试验装置本身中的滤器来去除细胞。在细胞裂解方法中，片段化，并典型地溶解细胞(例如血细胞)的膜，例如通过使用去污剂，从而允许所述物质通过膜的孔。特别用于即时检验或改进的实验室情形的快速试验一般应限至于少量的(优选简单的)步骤和仅几分钟的持续时间。这使单独分离细r>
胞的步骤变得不实际并意味着，液体(例如血浆)分离必须作为装置内的事件的整合部分，或必须使用裂解试剂或其他条件如去污剂，来裂解/溶解细胞壁和核膜以使样品通过滤膜的孔。特别是对用于定量测定的膜流通(flow-through)形式，裂解方法是有益的，因为难以用这种形式设计有效的血细胞分离。在用于即时检验的测定中，速度、灵敏度和准确度都是高度渴望的因素，但在测定的环境中，为了在某些因素(如速度)上给出可接受的性能，做一个“权衡”，在另一些因素(如灵敏度)上牺牲可能的提高经常是必需的。提供能共同提高这些性质从而在总体上显示更高性能水平做平衡的方法将具有巨大的价值。也称之为“免疫浓缩测定法”的膜流通测定法的形式是使用小孔径的，典型地是0.45μm的膜，该膜特定结合了如抗体、受体、抗体片段等部分。这个形式需要高度无颗粒的样品，因为即使是少量的具有同膜的孔径差不多大小或超过膜的孔径的颗粒，例如细胞碎片，都会降低通过膜的液体流通。在最坏的情况下，这能导致通过膜的液体输送的彻底停止，但即使是较小的膜流抑制也能导致流动问题和/或测定可靠性的劣化。因此，开发膜流通测定法时，关键问题是以能使任何含有细胞的样品通过膜，而在整个测定过程中没有改变膜的有效孔径的大小和流动性质的方式处理所述的样品。除此之外，红细胞压积校正是基于能用裂解(尤其是去污剂裂解)方法处理的全血的定量测定的另一个问题。特别是通过使细胞裂解，裂解物的简单的血红蛋白测量才可能进行红细胞压积校正。在全血或其它含有细胞的样品的(尤其是去污剂介导的)裂解中，主要目的是裂解细胞的膜和细胞核的膜，以允许其通过装置，尤其是通过滤器或膜。例如，去污剂侵入膜并产生胶团和蛋白质-去污剂复合物。胶团的大小通常足够小而使他们通过典型的0.45μm孔径的膜。类似地，离液序列高裂解剂(chaotrophic lysing agents)裂解在膜中支持的蛋白质结构并从而裂解它的结构。虽然膜类型测定中的(例如去污剂)裂解方法具有很多的优点，但极少有商业测定使用这个方法，特别是对自动测定系统。这一点的
一个原因可能是，当细胞膜彻底溶解成胶团是所期望的时，在环境中经常发生膜堵塞和流动受限。以往这种人为事情(artefactual)都不予以考虑或不理解，因为先前已经把在裂解测定中的膜运输的限制因素考虑为样品的细胞周围或细胞内的膜的裂解。例如，在血样中，先前已经将细胞膜或白细胞核膜的不充分溶解认为是膜堵塞的主要原因。
技术实现思路
现在，同先前理解的裂解细胞样品的情况相反，本专利技术不可思议地证实，甚至非常少的量的细胞核酸，特别是DNA，能导致膜的决定速度的堵塞和高背景测定信号。因此，在第一方面，本专利技术提供了一种含有细胞的身体样品的测定方法，所述方法包括在导致细胞裂解的条件下处理所述样品；并将由此产生的裂解样品置于导致核酸分子尤其是DNA分子断裂的条件下。优选地，导致细胞裂解的条件包括加入如去污剂等细胞裂解剂。优选地，所述方法是膜测定方法，更优选地，如下述的“膜捕获”测定方法。所述方法可选择地和优选地包含(随后将样品通过膜)测定样品(例如样品通过膜的那部分或优选地样品保留在膜上或被膜保留的那部分)的至少一种组分，或所述样品中的潜在组分和/或可选择地和优选地将测定值与含有细胞的身体样品中的测定的组分的定性、半定量或定量内容相关联，和/或可选择地和优选地将测定的组分同至少一种医学或生物学状况相关联。本专利技术人证实测定装置中膜堵塞的原因是核酸而不是脂质组分的不充分溶解，当将这样的膜用于浓缩样品中的组分时，既需要提高通过小孔径膜的流通，也需要降低背景信号。因此提高流动更迅速的进行测定和/或允许在相同周期内处理更大体积的样品，从而允许从大体积样品中浓缩分析物，并继而提高灵敏度和准确度。因而，在进一步的方面，本专利技术提供核酸断裂条件在所述测定方法中的用途，该方法包括裂解的含有细胞的身体样品通过孔径不超过10μm的膜的流动。这个用途提高了所述测定的性能，并可采取一种或多种形式，或可能提高性质的总体平衡。优选地，所述用途在膜浓缩测定中增强液体流通膜和/或降低膜上的背景信号和/或增加测定的速
度。仍然是在进一步的方面中，本专利技术也提供了整合了用于接受含有细胞的体液的室以及至少一种其孔径不超过10μm的膜的测定装置，其中使用的所述装置提供核酸断裂条件。优选地，该装置含有至少一种核酸断裂的化学和/或生物装置(means)，例如本文下面描述的那些。然后使用该装置提供核酸断裂的条件。仍是在进一步的方面中，本专利技术提供含有细胞的生物液体测定的试剂盒，所述试剂盒包括：包含孔径小于大约10μm的膜的装置；和至少一种核酸断裂的化学和/或生物装置。可选择地和优选地，试剂盒包含至少一种细胞裂解的装置，例如去污剂和/或至少一种所述样品的组分或潜在组分的测定的试剂。进一步可选择地和优选地，试剂盒包含使用方法说明书，该方法包括所述细胞的裂解(例如去污剂介导的裂解)，然后断裂释放的核酸分子，使至少一部分得到的样品通过所述的膜。最优选地，该方法是如本文所述的本专利技术的方法。具体实施方式如本文提及的，导致核酸链断裂的条件可以是物理条件(如摇动、搅拌和涡旋等)、放射性条件(例如用电磁辐射进行处理，例如UV、X-射线或γ-射线辐射)、化学条件(例如控制pH和/或氧化还原条件)和/或生物条件(例如用酶处理和/或具有核酸裂解性质的内源酶如核酸酶的激活)。优选的导致核酸断裂的条件是放射性的、化学的和生物学的条件，特别是加入至少一种的和/或内源酶进行处理。本专利技术人已经广泛本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有细胞的身体样品的测定方法，所述方法包含在导致细胞裂解的条件下处理所述样品，并将产生的裂解样品置于导致核酸分子断裂的条件下。

【技术特征摘要】
2005.10.31 GB 0522193.21.一种含有细胞的身体样品的测定方法，所述方法包含在导致细胞裂解的条件下处理所述样品，并将产生的裂解样品置于导致核酸分子断裂的条件下。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述测定是膜测定。3.一种提高膜测定方法性能的方法，包含以下步骤；i)裂解含有细胞的样品以提供裂解样品，其中细胞含有核酸；ii)断裂该核酸借此提供断裂的样品；iii)将断裂的样品与膜接触从而使部分断裂的样品通过该膜，而该膜保留部分断裂样品；其中可连续地或同时进行步骤ii)和iii)。4.根据权利要求1到3任一项所述的方法，其中所述测定是膜浓缩测定。5.根据权利要求1到4任一项所述的方法，其中通过物理条件、放射性条件、化学条件和/或生物条件提供核酸分子的断裂。6.根据权利要求5所述的方法，其中通过选自微球菌核酸酶、S1核酸酶、绿豆核酸酶、DNA酶I、核酸酶BAL 31或BenzonaseTM的生物试剂提供所述生物条件。7.根据权利要求6所述的方法，其中以干燥形式提供所述核酸酶。8.根据权利要求1到7任一项所述的方法，其中细胞裂解是去污剂裂解、低渗裂解、高渗裂解或离液序列高裂解。9.根据权利要求8所述的方法，其中通过选自阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂或非离子表面活性剂的去污...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·霍尔特伦德，A·坎贝尔，M·博克，
申请(专利权)人：阿克西斯希尔德公司，
类型：发明
国别省市：挪威;NO