本发明专利技术涉及一种富集4000人类致病靶基因的方法及试剂盒，包括以下步骤：DNA打碎得到DNA片段，末端修复，加A，加接头，进行Pre‑Capture LM‑PCR；将4000人类致病靶基因的Pre‑capture LM‑PCR产物混合得到混合文库样本，使用4000人类致病靶基因特异性探针文库与混合文库样本杂交，磁珠捕获DNA并洗脱；进行Post‑capture LM‑PCR。所述试剂盒包含DNA末端修复试剂、加A试剂、加接头试剂、LM‑PCR试剂和捕获试剂。本发明专利技术选择4000个人类致病基因作为的靶点并组合在一起，通过生物素探针捕获技术一次性富集这些个基因序列，并行高通量测序，可同时检查基因的多种变异类型，检测敏感度高，可使4000致病基因成为临床上的主要诊断检测手段，有利于降低成本，减少漏诊，提高检测阳性率，利于其临床推广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因检测领域，尤其涉及一种富集4000人类致病靶基因的方法及试剂盒。
技术介绍
人类基因组是由23对染色体组成，含有约30亿个DNA碱基对。人类基因组计划中调查人类基因组中的真染色质基因序列含有大约20000到25000个蛋白质编码基因。蛋白质编码序列(也就是外显子)在人类基因组中少于1.5％。在基因与调控序列之外，仍然有许多功能未知的广大区域，包括许多重复序列、转位子或伪基因等。当一个或多个基因发生不正常表现时，便可能会使某个相对应的表型产生一些临床症状。遗传异常的原因包括了基因突变和染色体数目异常。如果受损的基因会从亲代遗传到子代，那就会成为一种遗传性疾病。目前已知有大约7000种遗传疾病，但只有近4000个基因是有明确人类致病机制的，并且能够在家族中进行传递。基因检测是从血液、其他体液或细胞中检测一个人的DNA序列，对受检者基因编码的序列进行测定和定位比对分析。但如何有效、低成本对人类致病基因中识别导致特殊疾病的几个突变是有非常大的挑战性。这是因为，当对20000个人类基因进行检测，有16000个基因的功能不明，对测序数据的大量使用造成对外显区域的低覆盖，从而造成很大程度的漏诊。如果对全部20000个基因的外显子的使用高通量测序方法进行测序检测，成本非常高，不利于其临床推广。高通量测序技术也称二代测序、下一代测序技术、深度测序或大规模平行测序，它是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。其核心思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。目前，主要有三种主流的测序平台：illumina公司Hiseq平台、life technologies公司的PGM平台以及Roche公司的454平台。高通量测序技术由于其超高的测序能力在科研和临床中具有极为重要的应用。然而，虽然二代测序大大降低了DNA分析的成本，其样本制备过程依然繁琐，成为其今后广泛应用中的一种障碍。因此，人们对其DNA文库构建方法进行了大量研究，以期简化样本的制备步骤，获得高质量的检测样本。
技术实现思路
有鉴于此，有必要针对上述的问题，本专利技术提供一种富集4000人类靶基因的方法及试剂盒。本专利技术从OMIM、HGMD、UniProt、HUGO、NCBI和Refseq数据库以及目前已知的人类致病基因中选择4000个作为的靶点并组合在一起。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种富集4000人类致病靶基因的方法，包括以下步骤：S1、提取总DNA并将其打碎，得到DNA片段；S2、对DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段；S3、在平末端DNA片段3’端加A，得到加A的DNA片段；S4、在加A的DNA片段的3’端加接头，得到加接头的DNA片段；S5、对加接头的DNA片段进行Pre-capture LM-PCR；S6、将4000人类致病靶基因的Pre-capture LM-PCR产物混合得到混合文库样本，使用4000人类致病靶基因特异性探针文库与混合文库样本杂交，磁珠捕获DNA并洗脱；S7、磁珠捕获的DNA样本进行Post-capture LM-PCR。优选地，Pre-captureLM-PCR的反应体系如下：优选地，Pre-Capture LM-PCR的反应条件如下：98℃45sec；98℃ 15sec，60℃ 30sec，72℃ 30sec，9cycles；72℃ 1min；4℃。优选地，Post-captureLM-PCR反应的体系如下：优选地，Post-Capture LM-PCR反应的条件如下：98℃45sec；98℃ 15sec，60℃ 30sec，72℃ 30sec，14cycles；72℃ 1min；4℃。优选地，本专利技术中4000人类致病靶基因特异性探针与混合文库样本杂交步骤如下：向离心管中加入COT DNA和sample library，得到混合物1；混合物1中分别加入SeqCap HE Universal Oligo和SeqCap HE Index Oligos，得到混合物2；混合物2在DNA真空浓缩仪浓缩至液体蒸干，加入2×Hybridization Buffer和Hybridization Component A，得到混合物3；将混合物3混匀离心后置于95℃加热10min，加入4000人类致病靶基因特异性探针文库中，得到混合物4，混合物4在47℃孵育24小时。优选地，磁珠与DNA的结合方法为：将杂交的样本加入到预处理好的磁珠中，混匀后置于热循环仪中47℃结合45分钟。优选地，磁珠-DNA结合物依次使用Wash Buffer I、Stringent Wash Buffer、Wash Buffer I、Wash Buffer II和Wash Buffer III洗脱。优选地，所述步骤S2-S5和步骤S7包含纯化步骤。优选地，纯化步骤为：向样本中加入相应的反应液混匀，室温孵育10分钟，使DNA与磁珠充分结合；将管放置于磁力架上，直至溶液变清澈，弃掉上清，将管继续留在磁力架上，加入80％酒精，室温孵育30秒以上，吸走酒精，将管继续留在磁力架上，加入80％酒精，室温孵育30秒以上，吸走酒精；室温下充分干燥。更优选地，当需要将DNA与磁珠分离时，纯化后将管从磁力架上取出，加入ddH2O或pH 8.0的10mM Tris-HCl，室温孵育2分钟即可。一种富集4000人类靶基因的试剂盒，包含DNA末端修复试剂、加A试剂、加接头试剂、LM-PCR试剂和捕获试剂。优选地，所述捕获试剂包含4000人类致病靶基因特异性探针文库、捕获磁珠和标记序列。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术从OMIM、HGMD、UniProt、HUGO、NCBI和Refseq数据库以及目前已知的人类致病基因中选择4000个作为的靶点并组合在一起，通过生物素探针捕获技术一次性富集这些个基因序列，并行高通量测序，可同时检查基因的多种变异类型，检测敏感度高，可使4000致病基因成为临床上的主要诊断检测手段，有利于降低成本，减少漏诊，提高检测阳性率，利于其临床推广。本专利技术试剂盒便于致病基因的富集，简化了检测操作，节省时间。附图说明图1为本专利技术流程图。图2为步骤S1中片段打碎电泳图。图3为步骤S5中前LM-PCR产物纯化后电泳图。图4为步骤S7中后PCR产物纯化后电泳图。具体实施方式为了更好的说明本专利技术，下面结合附图和具体实施方式做进一步说明。除有特殊说明外，本专利技术中所用的试剂、设备或方法等都是本领域技术人员所熟知的，在此不再赘述。本专利技术中使用的以下试剂的配方如下：末端修复反应混合物(End Repair Master Mix，20μl)：水 8μl10×KAPA End Repair Buffer 7μlKAPA End Repair Enzyme Mix 5μl。加A反应混合物(A-Tailing Master Mix，50μl)：水 42μl1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种富集4000人类致病靶基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、提取总DNA并将其打碎，得到DNA片段；S2、对DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段；S3、在平末端DNA片段3’端加A，得到加A的DNA片段；S4、在加A的DNA片段的3’端加接头，得到加接头的DNA片段；S5、对加接头的DNA片段进行Pre‑Capture LM‑PCR；S6、将4000人类致病靶基因的Pre‑capture LM‑PCR产物混合得到混合文库样本，使用4000人类致病靶基因特异性探针文库与混合文库样本杂交，磁珠捕获DNA并洗脱；S7、磁珠捕获的DNA样本进行Post‑capture LM‑PCR。
【技术特征摘要】
1.一种富集4000人类致病靶基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、提取总DNA并将其打碎，得到DNA片段；S2、对DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段；S3、在平末端DNA片段3’端加A，得到加A的DNA片段；S4、在加A的DNA片段的3’端加接头，得到加接头的DNA片段；S5、对加接头的DNA片段进行Pre-Capture LM-PCR；S6、将4000人类致病靶基因的Pre-capture LM-PCR产物混合得到混合文库样本，使用4000人类致病靶基因特异性探针文库与混合文库样本杂交，磁珠捕获DNA并洗脱；S7、磁珠捕获的DNA样本进行Post-capture LM-PCR。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，Pre-Capture LM-PCR的反应体系如下：3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，Pre-Capture LM-PCR的反应条件如下：98℃45sec；98℃15sec，60℃30sec，72℃30sec，9cycles；72℃1min；4℃。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，Post-capture LM-PCR反应的体系如下：5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，Post-capture LM-PCR反应的条件如下：98℃45sec；98℃15sec，60℃30...
【专利技术属性】
技术研发人员：张巍，
申请(专利权)人：广州嘉检医学检测有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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