本发明专利技术公开了一种嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、CAR20-NKT细胞及其制备方法和应用，所述嵌合抗原受体为CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括串联的大鼠生长激素信号肽、CD20ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。采用本发明专利技术的CAR20-NKT细胞治疗进展期CD20阳性B细胞淋巴瘤时，能够有效避免采用现有靶向CD20的药物时引起的耐药性，对肿瘤细胞具有一定的特异杀伤活性，且对已经过多次治疗(如放疗、化疗及其他药物对症治疗等)但均无明显疗效的进展期CD20阳性B细胞淋巴瘤患者有一定的治疗效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于肿瘤生物制品领域，具体地，涉及过继免疫治疗中的一种嵌合抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重组表达载体、工程化CD20靶向性的NKT细胞(CAR20-NKT细胞)及其制备方法和应用。
技术介绍
自然杀伤细胞(NKT)是一种特殊类型的T淋巴细胞亚群，具有T细胞和NK细胞细胞两重性质。NKT细胞能表达T细胞的TCR与NK细胞的NKR-P1两种受体，在TCR和NKR介导下，NKT细胞能够产生大量的IL-4及INFγ，对肿瘤细胞发挥细胞杀伤作用。NKT细胞通过自身表面的CD16与特异性抗体的Fc段结合，发挥抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)。但在抗体依赖的细胞介导的杀伤作用过程中，由于抗体能与靶细胞上的相应抗原表位特异性结合，NKT细胞可杀伤任何已与抗体结合的靶细胞，因此抗体与靶细胞上的抗原结合是特异性的，但NKT细胞对靶细胞的杀伤作用是非特异性的。另外，通常情况下，输注的NKT细胞在患者体内半衰期为2周左右，有效期短暂，需要反复多次输注。而且，NKT细胞本身缺少特异性抗体，不足以在肿瘤周围或者瘤巢中富集，制约了NKT细胞对恶性肿瘤的靶向治疗。再者，研究表明，NKT细胞并不是对所有的肿瘤都有杀伤效果，且对部分肿瘤的杀伤作用比较弱，特异杀伤活性有待提高。CD20分子是一种B细胞分化抗原，仅表达于前B细胞和成熟B细胞表面，表达于95％以上的B细胞性淋巴瘤，而在造血干细胞、浆细胞和其他正常组织细胞中不表达。重要的是，CD20分子在膜上比较暴露， 容易接近，与单克隆抗体结合后无显著内化及脱落，也不会因为与抗体的结合而发生抗原调变，故成为治疗B细胞淋巴瘤的理想靶点。目前，在治疗进展期CD20阳性B细胞淋巴瘤患者时，抗CD20的药物治疗已经处于临床研究阶段，但是，临床结果表明，仅部分进展期CD20阳性B细胞淋巴瘤患者采用抗CD20的药物(如CD20单克隆抗体)治疗有效，并且患者最终会产生一定的耐药性，从而影响药物的疗效。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术中NKT细胞对肿瘤的杀伤作用比较弱、特异杀伤活性有待提高以及采用抗CD20的药物治疗进展期CD20阳性B细胞淋巴瘤患者时引起的耐药性的缺陷，提供一种嵌合抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重组表达载体、工程化CD20靶向性的NKT细胞(CAR20-NKT细胞)及其制备方法和应用。本专利技术的专利技术人在研究中意外发现，采用本专利技术的嵌合抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞治疗进展期CD20阳性B细胞淋巴瘤时，对淋巴瘤细胞具有很好的特异杀伤活性，且对已经过多次治疗(如CD20单克隆抗体、放疗、化疗及其他药物对症治疗等)但均无明显疗效的进展期CD20阳性B细胞淋巴瘤患者有一定的治疗效果。因此，为了实现上述目的，第一方面，本专利技术提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括串联的大鼠生长激素信号肽、CD20ScFv、CD8的铰链区(hinge区)和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。第二方面，本专利技术提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。第三方面，本专利技术提供了含有上述基因的重组表达载体。第四方面，本专利技术提供了一种工程化CD20靶向性的NKT细胞，所述NKT细胞是上述嵌合抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞。第五方面，本专利技术提供了一种工程化CD20靶向性的NKT细胞的制 备方法，所述方法包括：包装携带pWPXL-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的慢病毒，得到病毒浓缩液；利用得到的病毒浓缩液感染NKT细胞，使NKT细胞表达嵌合抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。第六方面，本专利技术提供了上述方法制备得到的工程化CD20靶向性的NKT细胞。第七方面，本专利技术提供了上述工程化CD20靶向性的NKT细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用。在治疗进展期CD20阳性B细胞淋巴瘤患者时，本专利技术的嵌合抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞，即工程化CD20靶向性的NKT细胞能够特异性结合CD20抗原，明显的延长免疫细胞在患者体内的存活时间，增强免疫细胞靶向识别癌细胞表面CD20抗原的能力，加强对CD20阳性靶细胞的特异杀伤活性，而且确实能够有效避免采用现有抗CD20的药物治疗时引起的耐药性，对已经过多次治疗(如放疗、化疗及其他药物对症治疗等)但均无明显疗效的进展期CD20阳性B细胞淋巴瘤患者有一定的治疗效果。本专利技术的工程化CD20靶向性的NKT细胞为治疗CD20阳性的肿瘤提供了一种新的选择，具有良好的产业应用前景。本专利技术的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明图1为流式细胞术对分离培养的NKT细胞表型分析的结果。图2为本专利技术的慢病毒表达载体pWPXL-CD8-CD137-CD3ζ的限制性内切酶MluI/NdeI双酶切片段的电泳鉴定图。图3为本专利技术的慢病毒表达载体pWPXL-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的限制性内切酶BamHI/NdeI双酶切片段的电泳鉴定图。图4为本专利技术的慢病毒表达载体pWPXL-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的结构示意图，其中，逆时针序列为正向基因片度，顺时针为反向基因片段。图5为流式细胞术检测含有嵌合抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的病毒浓缩液对NKT细胞的感染效率。图6为流式细胞术检测嵌合抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞(CAR20-NKT细胞)表型鉴定的结果。图7为本专利技术的CAR20-NKT细胞对CD20阳性的B细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用的细胞毒性分析图。图8为流式细胞术检测CAR20-NKT细胞回输至9例进展期CD20阳性的B细胞淋巴瘤患者中，CAR20-NKT细胞在患者外周血中的持续存在时间曲线图。图9为本专利技术的CAR20-NKT细胞对进展期CD20阳性的B细胞淋巴瘤患者治疗前与治疗后3个月PET-CT的对比图。具体实施方式以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。本专利技术提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括串联的大鼠生长激素信号肽、CD20单链抗体CD20ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。优选情况下，嵌合抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ由大鼠生长激素信号肽、CD20ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。进一步优选地，嵌合抗原受体具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，更进一步优选地，嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本专利技术提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。优选情况下，所述基因具有如SEQ 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为CD20ScFv‑CD8‑CD137‑CD3ζ，包括串联的大鼠生长激素信号肽、CD20ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域；优选地，所述嵌合抗原受体具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，进一步优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括串联的大鼠生长激素信号肽、CD20ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域；优选地，所述嵌合抗原受体具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，进一步优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.编码权利要求1所述的嵌合抗原受体的基因，优选地，所述基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，进一步优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.含有权利要求2所述的基因的重组表达载体，优选地，所述重组表达载体为慢病毒表达载体，进一步优选地，所述慢病毒表达载体为pWPXL-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。4.一种工程化CD20靶向性的NKT细胞，其特征在于，所述NKT细胞是由权利要求1所述的嵌合抗原受体修饰的NKT细胞。5.一种工程化CD20靶向性的NKT细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括：包装携带pWPXL-CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ的慢病毒，得到病毒浓缩液；利用得到的病毒浓缩液感染NKT细胞，使NKT细胞表达嵌合抗原受体CD20ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述方法还包括通过如下方法制备NKT细胞：(1)在CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15存在下，将单个核细胞进行第一阶段培养；优选地，所述第一阶段培养的实施方式包括：
\t将单个核细胞培养于第一NKT细胞培养液中，所述第一NKT细胞培养液含有NKT细胞培养基、CD3单克隆抗体、白介素-2和白介素-15；进一步优选地，第一NKT细胞培养液中，所述CD3单克隆抗体的浓度为30-70ng/mL，和/或所述白介素-2的浓度为300-700U/mL，和/或所述白介素-15的...
【专利技术属性】
技术研发人员：伍志强，韩为东，王晓慧，王瑶，郭业磊，代汉仁，张文英，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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