本发明专利技术公开了一种内切多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆、表达及应用，所述的内切多聚半乳糖醛酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3经过毕赤酵母表达，纯化后，比酶活高达4,757.4U/mg；rEPG3最适pH值为5.5，最适温度为55℃；在pH 3.0‑7.5下25℃处理24h还保持75.2％的酶活力，在45℃下处理1h之后还保持89.8％的酶活力，这说明此酶具有良好的pH稳定性和热稳定性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种能够分解聚半乳糖醛酸或果胶的内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3的应用。
技术介绍
果胶是一种主要由部分甲酯化的D-半乳糖醛酸经α-(1，4)-糖苷键聚合而成的多糖类物质。果胶是植物组织的重要组成部分，其广泛存在于高等植物组织中，尤其在果实、茎块、浆果中含量最为丰富。鉴于果胶结构的复杂性，果胶酶按其作用方式大致可以分为原果胶酶、果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶。在这些复合酶中，内切多聚半乳糖醛酸酶是最重要的组成部分，其能够随机水解由两个非甲酯化的半乳糖醛酸残基所组成的糖苷键，从而使高聚合度的果胶发生解聚。果胶酶是一类具有重要应用价值的复合酶，是全球产销量最大的工业酶制剂之一，其已被广泛应用于食品、饲料、造纸、纺织和果胶废液处理等领域。酸性果胶酶主要由真菌产出，并主要应用于食品领域，特别是果蔬汁、果酒的加工，其能够显著提高压榨果蔬汁的出汁率，降低果汁果酒的粘度，增加澄清效果，从而保证果汁果酒的品质。内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3具有较高的催化活性以及良好的pH稳定性和热稳定性，这些特征使得其具有较高的潜在应用价值。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种性质优良的内切多聚半乳糖醛酸酶。该酶含有379个氨基酸，其序列如SEQ ID NO:1所示。该酶属于内切多聚半乳糖醛酸酶的重组酶，记为rEPG3。其中，rEPG3的N端19个氨基酸为其预测的信号肽序列。因此，成熟的内切多聚半乳糖醛酸酶的蛋白rEPG3有360个氨基酸，序列如SEQ ID NO:2所示。所述的rEPG3的信号肽序列如SEQ ID NO:3所示。本专利技术克隆了这一内切多聚半乳糖醛酸酶基因，克隆得到的内切多聚半乳糖醛酸酶基因记为epg3，DNA全序列分析结果表明：epg3结构基因全长1419bp，含有4个内含子，序列如SEQ ID NO:4所示。所述的epg3的cDNA长1140bp，序列如SEQ ID NO:5所示。所述的epg3去除其信号肽序列后的cDNA序列如SEQ ID NO:6所示。其中，所述的epg3的信号肽的cDNA序列如SEQ ID NO:7所示。含有上述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌也是本专利技术保护的范围。上述重组载体为将上述DNA分子插入质粒得到的重组载体。上述重组载体包含在巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达的pPIC9K载体。本专利技术的重组载体具体为在pPIC9K载体的SnaB I和Avr II酶切位点间插入序列表中SEQ ID NO:6核苷酸得到的重组载体pPIC9K-rEPG3。上述重组菌为将所述重组载体导入宿主菌中得到的重组菌。上述宿主菌包含了重组载体pPIC9K-rEPG3的宿主菌，优选为酵母菌；所述酵母菌具体可为巴氏毕赤酵母。上述的DNA分子或上述的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌在制备内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术的另一个目的是提供一种制备内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3的方法，所述方法包括以下步骤：1)用pPIC9K-rEPG3重组载体转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)，筛选得到重组菌株GS115/rEPG3。2)培养重组菌株，甲醇诱导重组内切多聚半乳糖醛酸酶基因epg3的表达。3)回收并纯化所生产的内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3。本专利技术的实验证明，本专利技术从草酸青霉CZ1028的基因组序列中发现了一个编码内切多聚半乳糖醛酸酶的基因epg3，可在宿主细胞中表达该基因以生产内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3，用于降解聚半乳糖醛酸或果胶。对该内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3进行酶活力相关检测，其酶促反应的最适pH为5.5、最适温度为55℃；在最适pH和最适温度下，该酶对底物聚半乳糖醛酸的比酶活力为4,757.4U/mg；在pH3.0-7.5下25℃处理24h还保持75.2％的酶活力，在45℃下处理1h之后还保持89.8％的酶活力，说明此酶具有良好的pH稳定性和热稳定性。这些特征使得其具有较高的潜在应用价值。附图说明图1为草酸青霉CZ1028的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图。图2为草酸青霉CZ1028总RNA的琼脂糖凝胶电泳图。图3为草酸青霉CZ1028总RNA经过逆转录后的cDNA琼脂糖凝胶电泳图。图4为草酸青霉CZ1028基因组中含有一个假定内切多聚半乳糖醛酸酶全长基因的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。图5为草酸青霉CZ1028一个假定内切多聚半乳糖醛酸酶的cDNA的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。图6为草酸青霉CZ1028的一个假定内切多聚半乳糖醛酸酶的成熟蛋白质的编码区的基因序列。图7为重组质粒pPIC9K-rEPG3的构建。图8为重组巴氏毕赤酵母菌株GS115/rEPG3的菌液PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。图9为制备及纯化重组假定内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3的SDS-PAGE分析。图10为纯化的重组假定内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3水解聚半乳糖醛酸的产物的TLC分析。图11为内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3的最适作用pH和温度曲线。图12为内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3的pH耐受性曲线。图13为内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3的温度耐受性曲线。图14为内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3的酶反应动力学常数Km和Vmax的测定。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如没有特别提及，均采用本领域的通用方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值或平均值±标准偏差。1.菌株、载体、酶、试剂盒及糖类物质来源草酸青霉CZ1028为本实验室通过草酸青霉(Penicillium oxalicum)诱变筛选得到的高产多聚半乳糖醛酸酶菌株，已保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC3.15505，保藏方式为公开保藏，公众可以获得。巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115购自Invitrogen公司(California,USA)。表达载体pPIC9K购自Invitrogen公司(California,USA)。限制性内切酶SnaB I和Avr II、T4DNA连接酶及用于PCR的LA Taq酶均购自TaKaRa公司(辽宁，中国)，糖苷内切酶H购自New England Biolabs公司(北京，中国)。用于cDNA第一条链合成的反转录试剂盒购自TransGen Biotech公司(北京，中国)，用于RNA提取的RNAiso Plus、用来连接PCR产物的pMDTM18-T载体克隆试剂盒和用于PCR的
TaqTM Hot Start Version试剂盒都购自TaKaRa公司(辽宁，中国)，Bradford法蛋白浓度测定试剂盒购自捷瑞生物公司(上海，中国)。半乳糖醛酸、三半乳糖醛酸、聚半乳糖醛酸、橘皮果胶和苹果皮果胶均购自Sigma公司。2.培养基1)真菌培养基固态斜面培养基采用马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(PDA)。提取RNA和DNA所用的产酶液体培养基成分为(g/l)：橘皮果胶10,(N本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3，其特征在于，其氨基酸序列如下：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
1.一种内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3，其特征在于，其氨基酸序列如下：SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。2.一种编码权利要求1所述的内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3的基因epg3，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示。3.包含权利要求2所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞系或重组菌。4.权利要求3所述的重组载体为将权利要求2所述DNA分子插入表达质粒得到的重组载体。5.权利要求3所述的重组菌为将权利要求4所述的重组载体导入宿主...
【专利技术属性】
技术研发人员：程忠，陈东，卢波，罗贞贞，朱绮霞，芦志龙，黄日波，
申请(专利权)人：广西科学院，
类型：发明
国别省市：广西;45
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