一种高效稳定的果树RNA提取方法技术

本发明专利技术涉及一种高效稳定的果树RNA提取方法，特别是涉及一种改良的CTAB法提取多年生草本、木本以及藤本果树RNA的方法，经过检验在草莓、苹果、葡萄的组培苗以及大田苗等不同类型果树物种各组织中都可以使用，所提取获得的果树各组织RNA纯度高、效果良好。通过核酸分析发现，本方法可以有效去除果树组织细胞中特有的酚类物质、蛋白质、多糖及小分子盐离子等次生代谢物质，为分子生物学实验中RNA提取制备的良好选择。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种高效稳定的果树RNA提取方法，属于分子生物学

技术介绍
随着果树基因组数据的逐渐丰富，越来越多的果树物种基因组信息得到了注释。因此开展果树分子生物学对于挖掘功能基因以及通过基因工程等手段为果树育种服务的目标被越来越多的果树育种工作者所接受。果树作为多年生木本或草本植物，因其多年生的特点多富含多酚、多糖等果树特有次生代谢物质，给果树RNA的提取及纯化工作带来了许多麻烦。生物试剂盒对于分子生物学研究具有快速、简便的优点，但现今市场上尚没有针对于果树物种RNA提取的试剂盒，因而申请者在本方法开发前期利用广谱的植物RNA提取试剂盒提取果树物种RNA，发现其具有不稳定的特点。常用的传统RNA提取方法有，Trizol方法、苯酚法、氯化锂沉淀法、异硫氰酸胍法以及SDS/酚抽提方法，以上方法具有价格昂贵和费时费力的特点，且得到的果树RNA产量较少。此外申请者通过实验，对比发现Trizol方法多适用于草本植物，不适用于果树以及木本植物材料的RNA提取。本专利技术主要阐述利用改良的CTAB法提取果树不同代表物种草莓(草本)、苹果(木本)以及葡萄(藤本)的不同组织RNA，并说明其关键要领，以期为果树分子生物学研究者提供基础、准确的RNA提取方法，方便后续研究。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种高效稳定的果树RNA提取方法，核心内容是利用CTAB裂解液使果树组织细胞内的核酸物质得以释放，进而利用氯仿、异戊醇以及水饱和酚等试剂进行抽提，以彻底去除果树组织内的多糖多酚等果树特有次生代谢物质，得到高纯度且完整的果树RNA。本专利技术的特征是为果树分子生物学工作者提供一种高效稳定，并且不依赖任何过滤柱或试剂盒的果树RNA提取方法。具体步骤是：A裂解：取待提取RNA的果树试材(除果实外的组织取材约0.5-1.0g，果实1.5-2.0g)，置于液氮中迅速研磨成粉末，将1000μl CTAB裂解液和20μlβ-巯基乙醇依次加入2ml离心管(需65℃提前预热)，65℃水浴30min，水浴过程中每隔10min将离心管上下颠倒约30次，以保证待提取试材与CTAB裂解液充分接触。所述CTAB裂解液母液的配方：①5M NaCl(使用浓度为1.4M)。②0.5M EDTA-2Na(PH 8.0，使用浓度20mM)。注：磁力搅拌器剧烈搅拌，加入NaOH调PH至8.0可溶解。③1M Tris-HCl(pH 8.0，使用浓度0.1M)，注：用HCl调PH至8.0。④2％(w/v)CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，Cetyltrimethylammonium bromide)。⑤2％(w/v)PVP(聚乙烯吡咯烷酮K-30，Polyvinylpyrrolidone K-30)。B抽提：①加入等体积(1000μl)的氯仿：异戊醇(24∶1)，旋涡混匀，8000g 4℃离心10min。②取上清800μl，加入1/2体积的水饱和酚(PH 4.5)，混匀，静置5min，再加入1/2体积氯仿：异戊醇(24∶1)，旋涡混匀；8000g 4℃离心10min。③取上清600μl(1.5ml离心管操作)，加入1/30体积的NaAc(3M，PH 5.2)和1/10体积的无水乙醇，混匀后静置5min，8000g 4℃离心10min。④取上清450μl，加入1/3体积的LiCl(10M)，-20℃静置2-3h，8000g 4℃离心15min。⑤弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀2-3次，再用无水乙醇洗涤沉淀1次，室温干燥。溶于ddH2O(RNase free)中，-70℃保存备用；C检测：①取2μl总RNA，1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳仪电压不宜设置过大(140V为适宜电压)，否则会因产热引起RNA样品降解。②RNA样品上核酸仪检测，体系为1μl RNA样品加入49μl ddH2O(RNase free)，RNA浓度、OD280/OD260和OD260/OD230直接从仪器上读取。提取所得RNA OD260/OD280比值正常范围为：1.8-2.0，比值偏小说明RNA样品中有杂质蛋白污染；比值偏大说明RNA降解严重。苯酚在低pH的情况下可促进水相中的蛋白和DNA向有机相分配，从而最大限度的去除总RNA中的蛋白和DNA，因此在抽提过程中需加入水饱和酚(PH 4.5)。正常提取所得RNA OD260/OD230≥2，若比值偏小或琼脂糖凝胶点样孔模糊，说明所提取的RNA样品中含有杂质多糖、多酚或其他盐类小分子物质。本专利技术的优点在于：最大限度提高果树RNA提取效率及稳定性，所提取获得的RNA样品纯度高、无降解，可直接用于下游实验。本专利技术与传统方法相比较高效稳定，并且不依赖任何过滤柱或试剂盒，降低了操作成本及毒性伤害。附图说明图1为使用本方法提取具有代表性的草本、木本以及藤本果树的根、茎、叶片以及果皮、果肉样品的RNA电泳图。图2为使用本方法提取草莓、苹果、葡萄组培苗的根、茎和叶片以及葡萄大田苗的根、茎、叶片及果皮、果肉样品RNA浓度及OD值。图3为使用本方法提取葡萄大田苗各组织RNA为模板进行反转录得到cDNA后，继续PCR扩增的产物琼脂糖电泳图。具体的实施方式本专利技术提供一种高效稳定的果树RNA提取方法，所用试剂及耗材均为常规实验室所具有，不依赖任何商用试剂盒及过滤柱，以实现操作简便、结果稳定，且节本高效和低毒的目的。结合最佳实施例对本专利技术进行详细说明，方法和步骤如下：实施例--苹果茎RNA的提取采用一年生苹果砧木M9(株高40cm，茎粗0.7cm)的茎基部为试材，立即置于液氮中带回实验室，放置-70℃冰箱中待用。取苹果砧木试材(约0.5-1.0g)，置于液氮中迅速研磨成粉末，将1000μl CTAB裂解液和20μlβ-巯基乙醇依次加入2ml离心管(需提前进行65℃预热)，65℃水浴30min。水浴过程中每隔10min将离心管上下颠倒约30次，以保证待提取试材与CTAB裂解液充分接触。加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，旋涡混匀，8000g 4℃离心10min取上清800μl，加入1/2体积的水饱和酚(PH＝4.5)，混匀，静置5min，再加入1/2体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，旋涡混匀，8000g 4℃离心10min。取上清600μl(1.5ml离心管操作)，加入1/30体积的NaAc(3M，PH＝5.2)和1/10体积的无水乙醇，混匀后静置5min，8000g 4℃离心10min。取上清450μl，加入1/3体积的LiCl(10M)，-20℃静置2-3h；8000g 4℃离心15min；弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀2次，再用无水乙醇洗涤沉淀1次，室温干燥。溶于ddH2O(RNase free)中，-70℃保存备用。取2μl苹果茎RNA样品，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳仪电压不宜设置过大，否则会因产热引起RNA样品降解。将苹果茎RNA样品上核酸仪检测，体系为1μl RNA样品加入49μl ddH2O(RNase free)，
RNA浓度、OD280/OD260和OD260/OD230直接从仪器上读取。实施例--葡萄果皮、果实RNA的提取本实例中将实例一步骤中氯仿：异戊醇抽提离心的时间由本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术所述的一种高效稳定的果树RNA提取方法，其主要特征在于：A裂解：取待提取RNA的果树试材(除果实外的组织取材约0.5‑1.0g，果实1.5‑2.0g)，置于液氮中迅速研磨成粉末，将1000μl CTAB裂解液和20μlβ‑巯基乙醇依次加入2ml离心管，65℃水浴30min。水浴过程中每隔10min将离心管上下颠倒30次左右，以保证待提取试材与CTAB裂解液充分接触。所述CTAB裂解液母液的配方：①5M NaCl(使用浓度为1.4M)。②0.5M EDTA‑2Na(PH 8.0，使用浓度20mM)。注：磁力搅拌器剧烈搅拌，加入NaOH调PH至8.0溶解。③1M Tris‑HCl(pH 8.0，使用浓度0.1M)，注：用HCl调PH值至8.0。④2％(w/v)CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，Cetyltrimethylammonium bromide)。⑤2％(w/v)PVP(聚乙烯吡咯烷酮K‑30，Polyvinylpyrrolidone K‑30)。B抽提：①加入等体积(1000μl)的氯仿∶异戊醇(24∶1)，旋涡混匀；8000g4℃离心10min。②取上清800μl，加入1/2体积的水饱和酚(PH 4.5)，混匀，静置5min后，加入1/2体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，旋涡混匀，8000g 4℃离心10min。③取上清600μl(1.5ml离心管操作)，加入1/30体积的NaAc(3M，PH 5.2)和1/10体积的无水乙醇，混匀后静置5min，8000g 4℃离心10min。④取上清450μl，加入1/3体积的LiCl(10M)，‑20℃静置2‑3h，8000g 4℃离心15min；⑤弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀2‑3次，再用无水乙醇洗涤沉淀1次，室温干燥。溶于ddH2O(RNase free)中，‑70℃保存备用。C检测：①取2μl总RNA，1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳仪电压不宜设置过大(140V为适宜电压)，否则会因产热引起RNA样品降解。②将RNA样品上核酸仪检测，体系为1μl RNA样品加入49μl ddH2O(RNase free)，RNA浓度、OD280/OD260和OD260/OD230直接从仪器上读取。提取所得RNA OD260/OD280比值正常范围为：1.8‑2.0，比值偏小说明RNA样品中有杂质蛋白污染；比值偏大说明RNA降解严重。苯酚在低pH的情况下可促进水相中的蛋白和DNA向有机相分配，从而最大限度的去除总RNA中的蛋白和DNA，因此在抽提过程中需加入水饱和酚(PH 4.5)。正常提取所得RNA OD260/OD230≥2，若比值偏小或琼脂糖凝胶点样孔模糊，说明所提取的RNA样品中有杂质多糖、多酚或其他盐类小分子物质。...

【技术特征摘要】
1.本发明所述的一种高效稳定的果树RNA提取方法，其主要特征在于：A裂解：取待提取RNA的果树试材(除果实外的组织取材约0.5-1.0g，果实1.5-2.0g)，置于液氮中迅速研磨成粉末，将1000μl CTAB裂解液和20μlβ-巯基乙醇依次加入2ml离心管，65℃水浴30min。水浴过程中每隔10min将离心管上下颠倒30次左右，以保证待提取试材与CTAB裂解液充分接触。所述CTAB裂解液母液的配方：①5M NaCl(使用浓度为1.4M)。②0.5M EDTA-2Na(PH 8.0，使用浓度20mM)。注：磁力搅拌器剧烈搅拌，加入NaOH调PH至8.0溶解。③1M Tris-HCl(pH 8.0，使用浓度0.1M)，注：用HCl调PH值至8.0。④2％(w/v)CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，Cetyltrimethylammonium bromide)。⑤2％(w/v)PVP(聚乙烯吡咯烷酮K-30，Polyvinylpyrrolidone K-30)。B抽提：①加入等体积(1000μl)的氯仿∶异戊醇(24∶1)，旋涡混匀；8000g4℃离心10min。②取上清800μl，加入1/2体积的水饱和酚(PH 4.5)，混匀，静置5min后，加入1/2体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，旋涡混匀，8000g 4℃离心10min。③取上清600μl(1.5ml离心管操作)，加入1/30体积的NaAc(3M，PH 5.2)和1/10体积的无水乙醇，混匀后静置5min，8000g 4℃离心10min。④取上清450μl，加入1/3体积的LiCl(10M)，-20℃静置2-3h，8000g 4℃离心15min；⑤弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀2-3次，再用无水乙醇洗涤沉淀1次，室温干燥。溶于ddH2O(RN...

【专利技术属性】
技术研发人员：关玲，赵密珍，吴伟民，钱亚明，王庆莲，王西成，王静，陈晓东，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32