一种马秋波病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法技术

本发明专利技术涉及一种快速、简便、灵敏的马秋波病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法。本发明专利技术的检测方法原理是以间接免疫荧光法检测人抗马秋波病毒糖蛋白抗体。载玻片上是包被能表达马秋波病毒糖蛋白的293F细胞，阳性对照或阳性样品中抗糖蛋白抗体在结合到细胞表面后，用荧光染料标记二抗捕获后在荧光显微镜下观察，可见绿色的荧光细胞，判定为马秋波病毒IgG抗体阳性。若样本中无马秋波病毒抗体，细胞不显示荧光。检测方法包括如下步骤：293F细胞载波片的制备，载波片上加入样本，荧光标记二抗的结合，洗涤，荧光检测，结果判定。本发明专利技术能对马秋波病毒进行快速灵敏的检测，操作简便，通过本发明专利技术可大幅度提高出入境口岸一线检验检疫人员的检测效率，对防控外来烈性传染病的输入具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及体外诊断试剂
，具体涉及一种马秋波病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法。背景介绍随着全球经济一体化和贸易自由化，国外的医学媒介生物通过先进的交通工具和国际贸易，可以迅速把传染病从一个国家或地区传向全球，造成国际间传播。近年来,烈性病毒性传染病在世界各国频频暴发流行,对人类健康带来严重威胁,给社会造成巨大经济损失。这些烈性病毒性传染病的频发给我们敲响了警钟,加强对其的研究和监测以及早预防控制是至关重要的。马秋波病毒(Machupo Virus)是一种沙粒病毒。1962年首次在玻利维亚发现，该病毒由老鼠携带。染病初期表现为发烧，然后鼻子和牙龈开始出血，胃肠内出血，30％的感染者会死亡。病毒体积小但威力大。一个健康细胞的细胞核中携带着遗传物质——基因，病毒攻击的目标正是这些基因。病毒将自己的DNA注入细胞基因中，使它们复制更多的病毒。病毒侵入细胞的方式非常复杂，但病毒是一种寄生生物，一旦这些新制造出来的病毒离开宿主，它们就必须尽快找到新的宿主，否则就会灭绝。世界上六种神秘病毒最致命，马秋波病毒是其中之一。马秋波病毒在我国尚未流行,但随着我国商贸、旅游业的快速发展,境内外人员交往日益密切,以及动物的进口等影响,烈性病毒输入的危险性日益增高，因此,尽快建立快速简便、特异敏感的检测方法防范马秋波病毒输入并控制其暴发流行具有重要意义。对马秋波病毒的检测技术的国内目前研究不多，目前已知的相关研究是中国检验检疫科学研究院的姚李四等人通过荧光定量PCR检测方法检测病毒及通过大肠杆菌表达系统马秋波病毒目的蛋白继而通过免疫方法对病毒进行检测，这两种检测方法均不够简便、快速。本专利技术提供的IgG抗体间接免疫荧光法可检测人抗马秋波病毒糖蛋白抗体，为马秋波病毒的检测提供了快速，简便，灵敏的免疫荧光检测方法，本专利技术可大幅度提高进出口口岸一线检验检疫人员的检测效率，最大限度地防止外来输入性传染病的发生。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏的马秋波病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法。本专利技术的马秋波病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，包括如下步骤：1.表达马秋波病毒糖蛋白的293F细胞载波片的制备:将Expi293F细胞经贴壁培养至细胞状态良好时，经胰酶消化后细胞计数，将细胞密度调整至4X105个/毫升后，在Chamber Slide板上以250ul/孔加入细胞悬液，轻柔摇晃，置于细胞培养箱中培养24小时。此时细胞基本铺满孔底，再用马秋波病毒糖蛋白的全长基因表达质粒进行细胞转染。用脂质体2000转染质粒，以1ug质粒/2ul脂质体2000转染试剂的比例进行。细胞转染48小时后，得到表达的马秋波病毒糖蛋白GP，用多聚甲醛进行细胞固定，固定完成再进行5％山羊血清封闭，封闭后用10％甘油封片2-8℃冷藏保存。2.样品稀释液和洗液的配置；3.表达马秋波病毒糖蛋白的293F细胞载波片的平衡：将表达有马秋波病毒糖蛋白的293F细胞载波片Chamber Slide从2-8℃取至室温中，放置10分钟。4.加入待测样品、阳性对照、阴性对照：每孔加入200ul，盖上Chamber Slide盖子，室温放置60分钟。5.吸掉上清液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重复一次。6.加入荧光标记二抗：每孔加入200ul，室温避光放置1小时，此步骤之后均需做避光处理，防止荧光衰退。7.吸掉样品溶液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重复一遍。8.结果判定：将Chamber Slide置于荧光显微镜下观察荧光,判定结果，有绿色荧光的为阳性反应，无绿色荧光则未有免疫反应，表示样本中不含有马秋波病毒抗体。步骤1所述的马秋波病毒为病毒株MARU 249121；步骤2所述的样品稀释液为5％山羊血清溶于0.01M PBS缓冲液中；洗液为0.05％的吐温20溶于0.01M PBS缓冲液中。步骤4所述的阳性对照为抗马秋波病毒糖蛋白GP的兔阳性血清，其制备包括如下步骤：将表达马秋波病毒糖蛋白GP的全长基因(MARU 249121)经分子克隆的方法克隆到GIneratorTM载体后，用基因免疫的方法免疫新西兰大白兔，经首次免疫、二次免疫后，耳静脉采血收集少量抗血清，经间接ELISA的方法检测抗血清的效价，效价检测合格后(>1:64000)进行加强免疫(二次免疫间隔3周后)，10天之后收集抗血清；未免疫新西兰大白兔作为阴性对照,同时进行与阳性对照制备一样的操作和检测。步骤4所述阳性对照用稀释液1：100稀释，阴性对照用稀释液1：100稀释。步骤6所述的荧光标记二抗为羊抗兔与羊抗人二抗混合液；荧光二抗混合液加入前用样品稀释液1:2000倍稀释。马秋波病毒在我国尚未流行,由于阳性样品的来源受限使得对马秋波病毒的快速检测技术的相关研究较少，但做为口岸一线检验检疫，需有马秋波病毒检测方法的技术储备。本专利技术以间接免疫荧光法检测人抗马秋波病毒糖蛋白抗体。载玻片上是包被能表达马秋波病毒糖蛋白的293F细胞，阳性对照或阳性样品中抗糖蛋白抗体在结合到细胞表面后，用荧光染料标记的二抗捕获后在荧光显微镜下观察，可见绿色的荧光细胞，判定为马秋波病毒IgG抗体阳性。此检测方法操作简单、节省时间、灵敏度高、特异性好，为马秋波病毒的检测提供了快速，简便，灵敏的免疫荧光检测方法。通过本专利技术可大幅度提高进出口口岸一线检验检疫人员的检测效率，既可减少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的阳性漏检问题，从而最大限度地防止外来输入性传染病的发生。附图说明图1实施例1中载波片外马秋波病毒糖蛋白表达后纯化的蛋白电泳图。图2实施例1中马秋波病毒检测阴性和阳性对照荧光检测图。图中，A为阳性对照的可见光图，B为阳性对照的荧光图，C为阴性对照的可见光图，D为阴性对照的荧光图。图3实施例1中马秋波病毒检测阳性模拟样本不同稀释浓度荧光检测结果。图中，A为高滴度阳性模拟样本(1:200)的可见光图，B为高滴度阳性模拟样本(1:200)的荧光图；C为中滴度阳性模拟样本(1:500)的可见光图，D为中滴度阳性模拟样本(1:500)的荧光图；E为低滴度阳性模拟样本(1:1000)的可见光图，F为低滴度阳性模拟样本(1:1000)的荧光图。 图4实施例1中马秋波病毒检测阴性样本荧光检测结果图。图中，A、C为健康人血清样本的可见光图，B、D为相应的健康人血清样本荧光图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1 马秋波病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法一、实验步骤 1.样本准备本实施例中，由于阳性样本来源受限，故用抗马秋波病毒糖蛋白GP的兔阳性血清用不同的稀释浓度做为模拟阳性样本和阳性对照，阴性对照样本为健康人的血清。2.材料、试剂、仪器Lab-Tek II Chamber Slide腔室玻片购自Nunc公司，GIneratorTM表达载体购自Immune Technology公司，Expi293FTM表达系统所有试剂购自Thermo F本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种马秋波病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法其特征在于：包括以下检测步骤：(1)表达马秋波病毒糖蛋白的293F细胞载波片的制备:将Expi293F细胞经贴壁培养至细胞状态良好时，经胰酶消化后细胞计数，将细胞密度调整至4X105个/毫升后，在腔室玻片Chamber Slide板上以250ul/孔加入细胞悬液，轻柔摇晃，置于细胞培养箱中培养24小时；此时细胞基本铺满孔底，再用马秋波病毒糖蛋白的全长基因表达质粒进行细胞转染；用脂质体2000转染质粒，以1ug质粒/2ul脂质体2000转染试剂的比例进行；细胞转染48小时后，得到表达的马秋波病毒糖蛋白GP，用多聚甲醛进行细胞固定，固定完成再进行5％山羊血清封闭，封闭后用10％甘油封片2‑8℃冷藏保存；所用的马秋波病毒为病毒株MARU 249121；(2)样品稀释液和洗液的配置；(3)表达马秋波病毒糖蛋白的293F细胞载波片的平衡：将表达有马秋波病毒糖蛋白的293F细胞载波片Chamber Slide从2‑8℃取至室温中，放置10分钟；(4)加入待测样品、阳性对照、阴性对照；(5)吸掉上清液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重复一次；(6)加入荧光标记二抗；(7)吸掉样品溶液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重复一遍；(8)结果判定：将载波片Chamber Slide置于荧光显微镜下观察荧光,判定结果，有绿色荧光的为阳性反应，无绿色荧光则未有免疫反应，表示样本中不含有马秋波病毒抗体。...

【技术特征摘要】
1.一种马秋波病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法其特征在于：包括以下检测步骤：(1)表达马秋波病毒糖蛋白的293F细胞载波片的制备:将Expi293F细胞经贴壁培养至细胞状态良好时，经胰酶消化后细胞计数，将细胞密度调整至4X105个/毫升后，在腔室玻片Chamber Slide板上以250ul/孔加入细胞悬液，轻柔摇晃，置于细胞培养箱中培养24小时；此时细胞基本铺满孔底，再用马秋波病毒糖蛋白的全长基因表达质粒进行细胞转染；用脂质体2000转染质粒，以1ug质粒/2ul脂质体2000转染试剂的比例进行；细胞转染48小时后，得到表达的马秋波病毒糖蛋白GP，用多聚甲醛进行细胞固定，固定完成再进行5％山羊血清封闭，封闭后用10％甘油封片2-8℃冷藏保存；所用的马秋波病毒为病毒株MARU 249121；(2)样品稀释液和洗液的配置；(3)表达马秋波病毒糖蛋白的293F细胞载波片的平衡：将表达有马秋波病毒糖蛋白的293F细胞载波片Chamber Slide从2-8℃取至室温中，放置10分钟；(4)加入待测样品、阳性对照、阴性对照；(5)吸掉上清液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重复一次；(6)加入荧光标记二抗；(7)吸掉样品溶液，每孔加入300ul洗液，10秒左右吸掉洗液，再重复一遍；(8)结果判定：将载波片Chamber Slide置于荧光显微镜下观察荧光,判定结果，有绿色荧光的为阳性反应，无绿色荧光则未有免疫反应，表示样本中不含有马秋波病毒抗体。2.根据权利要求1所述的马秋波病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤(2)所述的稀释液成分为5％山羊血清溶于0.01M的磷酸盐缓冲液PBS中，所述的洗液成分为0.05％吐温20溶于0.01M磷酸盐缓冲液中。3.根据权利要求1所述的马秋波病毒IgG抗体的间接免疫荧光检测方法，其特征在于：步骤(4)所述的阳性对照为抗马秋波病毒糖蛋白GP的兔阳性血清，其制备包括如下步骤：将表达马秋波病毒毒株MARU249121糖蛋白GP的全长基因经分子克隆的方法克隆到IneratorTM载体后，用基因免疫的方法免疫新西兰大白兔，经首次免疫、二次免疫后，耳静脉采血收集少量抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：李深伟，田桢干，査期，张子龙，胡孔新，
申请(专利权)人：中华人民共和国上海出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：上海;31