本发明专利技术提供一种内含三种食源性病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备方法。所述假病毒颗粒含有甲型肝炎病毒、轮状病毒和诺如病毒三种病毒的核酸片段。所述假病毒颗粒的制备方法包括步骤：(1)制备包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段；(2)将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体中，获得质粒载体；(3)将质粒载体转化入大肠杆菌感受态细胞中；(4)诱导DNA片段在大肠杆菌细胞中转录和/或翻译表达；(5)收集步骤(4)的大肠杆菌细胞，并进行破碎，从中纯化得到假病毒颗粒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种同时含有三种食源性病毒核酸片段的假病毒颗粒及其制备所用的质粒载体和方法。
技术介绍
据世界卫生组织统计，发达国家每年约有30％的人口患食源性疾病，而在发展中国家每年约有2.7亿人口患食源性疾病，导致200余万低龄儿童死亡。食源性病毒是引起食源性疾病的主要原因之一。甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)、轮状病毒(rotavirus，RV)、诺如病毒(norovirus，NV)是三种重要的食源性病毒，主要通过粪-口途径传播，受污染的食品和水是其最主要的传播方式。以RT-PCR与Real Time RT-PCR为代表的分子检测方法由于具有灵敏度高、重复性好、检测过程快捷等优点，在食源性病毒的检测方面得到广泛应用，并且成为受污染的食品、水等病毒含量较低样本的“金标准”检测方法。国内外研究学者基于不同的引物和探针，建立了数十种检测方法，国际标准化组织和我国也相继发布了多项国际标准、国家标准及行业标准，为食源性病毒的检测提供了重要的技术支撑与判定依据。由于多数食源性病毒不能进行常规细胞培养，因此这些检测方法多使用临床腹泻样本、灭活疫苗、质粒DNA或体外转录RNA作为阳性对照，以便对检测结果开展质量控制。但是，上述阳性对照样品均存在一定的缺陷，如临床腹泻样本的病毒粒子含量不均一且存在严重的生物安全隐患，质粒DNA不能用来评价病毒富集、RNA提取及转录效率等关键环节，灭活疫苗存在灭活不彻底的生物安全隐患，体外转录RNA有稳定性差等问题，并且上述阳性对照均只能针对某一种病毒，无法同时作为多种食源性病毒检测 的标准样品。因此，急需研发一种稳定性好、无生物安全隐患、具有与病毒类似的“内含RNA外有衣壳蛋白保护”结构、能同时适用于多种食源性病毒检测标准的阳性标准样品。
技术实现思路
基于上述问题，本专利技术的目的在于提供一种假病毒颗粒，该假病毒颗粒基于Qbeta噬菌体构建，同时包含甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒三种重要食源性病毒的核酸片段，用于作为检测该三种病毒的靶标，使得所述假病毒颗粒能同时作为三种食源性病毒核酸检测的标准阳性样品，应用于医院、食品卫生、质检、科研等检测机构。所述假病毒颗粒内同时含有甲型肝炎病毒、轮状病毒和诺如病毒三种病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测甲型肝炎病毒、轮状病毒和诺如病毒三种病毒的靶标。所述甲型肝炎病毒的核酸片段对应的cDNA序列优选是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列。所述轮状病毒的核酸片段对应的cDNA序列优选是序列表中SEQ ID No.2的DNA序列。所述诺如病毒的核酸片段对应的cDNA序列优选是序列表中SEQ ID No.3和/或序列表中SEQ ID No.4的DNA序列。优选地，所述假病毒颗粒通过质粒载体在大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译表达而制得，所述质粒载体含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒的核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段，所述DNA片段具有序列表中SEQ ID No.5所示的序列。优选地，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译表达。所述大肠杆菌优选是大肠杆菌BL21。本专利技术还提供一种用于制备假病毒颗粒的质粒载体，其含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段，所述核酸片段能用作检测甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒的靶标，所述DNA片段优选含有序列表中SEQ ID No.5所示的序列。优选地，所述质粒载体中还包括多克隆位点，所述多克隆位点位于所述DNA片段表达方向的下游，所述多克隆位点沿所述表达方向依次包括Apa I、Kpn I、Pst I、Spe I、Sph I和Not I。本专利技术还提供一种制备假病毒颗粒的方法，其包括以下步骤：(1)制备包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段；(2)将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体中，获得质粒载体；(3)将所述质粒载体转化入大肠杆菌感受态细胞中；(4)诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中转录和/或翻译表达；(5)收集步骤(4)的所述大肠杆菌细胞，并进行破碎，从中纯化得到所述假病毒颗粒。所述DNA片段优选含有序列表中SEQ ID No.5所示的序列。优选地，通过人工合成的方式制备所述DNA片段。优选地，通过同源重组的方式将所述DNA片段克隆至大肠杆菌原核表达载体pET-28a(+)中，来获得所述质粒载体。所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21。优选地，利用异丙基硫代半乳糖苷来诱导所述DNA片段在所述大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译表达。本专利技术提供的假病毒颗粒，由于其中同时包含了甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒的核酸片段，这些核酸片段能作为检测靶标，使得所述假病毒颗粒能同时作为三种食源性病毒核酸检测的标准阳性样品，应用于医院、食品卫生、质检、科研等检测机构，从而大大减少 了购置、运输、储存的成本与空间。其中，甲型肝炎病毒的核酸片段可以是例如国家标准GB/T 22287-2008中规定的甲型肝炎病毒检测靶标，轮状病毒的核酸片段可以是例如出入境检验检疫行业标准SN/T2520-2010规定的轮状病毒检测靶标，诺如病毒的核酸片段可以是例如国际标准ISO/T15216-2 2012中规定的诺如病毒检测靶标序列对应的RNA片段。本专利技术所提供的质粒载体包括从5'端到3'端依次为Apa I、Kpn I、Pst I、Spe I、Sph I和Not I的多克隆位点，这些酶切位点均在Qbeta噬菌体的克隆片段中缺失，从而可以依据需要十分方便地在该质粒载体的aMCS中插入其他RNA对应的cDNA，用于制备检测其它RNA病毒核酸时的标准样品。而且，与这些酶切位点对应的限制性内切酶价格十分便宜，可极大地降低生产成本。利用本专利技术所提供的制备假病毒颗粒的方法，能够方便可靠地获得拷贝数高、稳定性好的假病毒颗粒，仅需少量制备，通过稀释即可制备大量的标准样品，完全可以满足医院、食品卫生、质检、科研等检测机构的需要。附图说明图1是具体实施方式中QGHSRIN片段组成的示意图。图2是具体实施方式中质粒载体pET-QGHSRIN图谱示意图。图3是PCR扩增的QGHSRIN片段产物的琼脂糖凝胶电泳图。图4是质粒载体pET-QGHSRIN的酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图。图5是假病毒颗粒中残留质粒DNA检测的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道M是DNA分子量标准，泳道1是以质粒载体pET-QGHSRIN为模板的阳性对照的扩增结果，泳道2是以ddH2O为模板的阴性对照的扩增结果，泳道3和4是以待检测的假病毒颗粒为模板的扩增结果。图6是质粒载体pET-QGHSRIN在大肠杆菌BL21中表达产物的SDS-PAGE电泳图，其中M是蛋白质分子量标准，泳道1是大肠杆菌 BL21对照，泳道本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种假病毒颗粒，所述假病毒颗粒内同时含有甲型肝炎病毒、轮状病毒和诺如病毒三种病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒的靶标。
【技术特征摘要】
1.一种假病毒颗粒，所述假病毒颗粒内同时含有甲型肝炎病毒、轮状病毒和诺如病毒三种病毒的核酸片段，所述核酸片段能用于作为检测甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒的靶标。2.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述甲型肝炎病毒的核酸片段是与序列表中SEQ ID No.1的DNA序列相对应的RNA。3.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述轮状病毒的核酸片段是与序列表中SEQ ID No.2的DNA序列相对应的RNA。4.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述诺如病毒的核酸片段是与序列表中SEQ ID No.3和/或序列表中SEQ ID No.4的DNA序列相对应的RNA。5.根据权利要求1所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述假病毒颗粒通过质粒载体在大肠杆菌细胞中进行转录和/或翻译表达而制得，所述质粒载体含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及所述甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒的核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段，其中，所述甲型肝炎病毒的核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述轮状病毒的核酸片段对应的cDNA序列为序列表中SEQ ID No.2的DNA序列，所述诺如病毒的核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.3和/或序列表中SEQ ID No.4的DNA序列，所述DNA片段具有序列表中SEQ ID No.5所示的序列。6.根据权利要求5所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述质粒载体利用了原核表达载体pET-28a(+)的骨架，所述DNA片段插入到所述原核表达载体pET-28a(+)中，使得所述DNA片段能在T7启动子下进行转录和/或翻译表达。7.根据权利要求6所述的假病毒颗粒，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。8.一种用于制备假病毒颗粒的质粒载体，其含有包括Qbeta噬菌体的成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点序列以及甲型肝炎病毒、轮状病毒、诺如病毒核酸片段对应的cDNA序列在内的DNA片段。9.根据权利要求8所述的质粒载体，其特征在于，所述甲型肝炎病毒的核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列。10.根据权利要求8所述的质粒载体，其特征在于，所述轮状病毒的核酸片段对应的cDNA序列为序列表中SEQ ID No.2的DNA序列。11.根据权利要求8所述的质粒载体，其特征在于，所述诺如病毒的核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.3和/或序列表中SEQ ID No.4的DNA序列。12.根据权利要求8所述的质粒载体，其特征在于，所述甲型肝炎病毒的核酸片段对应的cDNA序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA序列，所述轮状病毒的核酸片段对应的cDNA序列为序列表中SEQ ID No.2的DNA序列，所述诺如病毒的...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚琳，江艳华，朱文嘉，郭莹莹，李风铃，王联珠，卢立娜，翟毓秀，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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