一种鱼类穿透素的应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体的说是一种鱼类穿透素的应用。鱼类穿透素在制备抑菌制剂中的应用。所述穿透素为穿透素重组蛋白。所述穿透素重组蛋白为在大肠杆菌中表达获得的重组蛋白。本发明专利技术重组穿透素用于制备抑菌制剂，即能显著抑制细菌生长。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域，具体的说是一种鱼类穿透素的应用。
技术介绍
穿透素PTX1(Pentraxin 1)属于正五聚蛋白(Pentraxins)家族，是一个分子量约为24.7kDa的胞外分泌型蛋白，由信号肽区和PTX结构域区(pentraxin domain)组成。作为一种典型的体液模式识别分子，一方面PTX1能通过识别多糖和细胞膜上的磷酸胆碱，结合多种微生物，如真菌、酵母菌、细菌和寄生虫；另一方面，PTX1能结合多种细胞核物质，如DNA、组蛋白、染色质和小核糖核酸蛋白等。PTX1与配体发生结合或凝集作用后可激活经典补体途径，引发炎症反应，增强调理作用。同时，PTX1-配体复合物能与FcγRⅠ型、FcγRⅡ型和FcγRⅢ型受体结合并激活相关信号通路，进而增强白细胞的吞噬作用，调节淋巴细胞或单核/巨噬系统功能，促进巨噬细胞组织因子的生成。因此，PTX1在脊椎动物非特异性免疫反应中发挥着重要的作用。然而，鱼类PTX1的功能研究甚少。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种鱼类(半滑舌鳎)穿透素的应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种鱼类穿透素的应用，鱼类穿透素在制备抑菌制剂中的应用。进一步，所述鱼类穿透素在制备抑制荧光假单胞菌的抑菌制剂中的应用。所述穿透素为穿透素重组蛋白。所述穿透素重组蛋白为经穿透素在大肠杆菌中表达获得重组蛋白。所述重组穿透素蛋白为以半滑舌鳎cDNA为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增,PCR产物经过与载体TBSC-T连接转换后与载体pET259连接，获得质粒pEtPTX1，转化大肠杆菌BL21(DE3)即可表达重组穿透素。所述F1为5’-GATATCATGGTTCCTCAAGACTTGTCTGG-3’；R1为5’-GATATCATCATCTGGTGCATCATCAA-3’。本专利技术具有如下优点：本专利技术的穿透素能够抑制鱼类病原菌。附图说明图1为本专利技术实施例提供的纯化的穿透素重组蛋白电泳图。其中，泳道1，分子量标准；泳道2,穿透素。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例旨在对本专利技术进行举例描述，而非以任何形式对本专利技术进行限制。实施例1穿透素PTX1的重组蛋白的制备1)表达穿透素PTX1重组蛋白的质粒pEtPTX1的构建：本专利技术中的穿透素PTX1的序列已报道(GenBank accession number XM_008323050.1)。穿透素PTX1具有典型的穿透素结构域(氨基酸19-214)。pEtPTX1的构建如下：以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增。PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA,然后94℃40s,55℃60s,72℃60s,5个循环后改为94℃40s,61℃60s,72℃60s,30个循环。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体TBSC-T(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)于室温连接2－4小时，连接混合液转化到大肠杆菌DH5α后在含有100μg/ml安卡青霉素、40μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷和24μg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB固体培养基上培养18－24小时，挑出白色转化子，提取质粒，命名为质粒TBSCPTX1。将表达载体pET259(pET259构建过程参见Hu YH,Zheng WW,Sun L.Identification and molecular analysis of a ferritin subunit from red drum(Sciaenops ocellatus).Fish Shellfish Immunol2010；28:678-86)用限制性内切酶SwaI酶切后回收5.3kb，同时将TBSCPTX1用EcoRV酶切回收0.7kb片段。将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2－4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，即为pEtPTX1。DNA测序表明pEtPTX1含有编码穿透素PTX1序列的基因。所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。所述F1为5’-GATATCATGGTTCCTCAAGACTTGTCTGG-3’；R1为5’-GATATCATCATCTGGTGCATCATCAA-3’。2)重组穿透素蛋白的诱导表达和纯化将上述的质粒pEtPTX1用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有卡那霉素(50ug/ml)的LB固体培养基上培养18－24小时,挑取转化子，将其命名为BL21/pEtPTX1。将BL21/pEtPTX1于含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液,加入100ml新鲜的 含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中，于37℃下转速200rpm摇动培养至OD600为0.6,加入终浓度为1mM的IPTG，28℃继续以转速160rpm摇动培养7-8h，而后以5000g，4℃离心10min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4℃离心30min，回收上清。将上清中的蛋白用亲和层析柱His Trap HP Columns(购于美国GE Healthcare公司)回收纯化，将纯化的蛋白悬浮于TBSC缓冲液。将纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测(8v/cm电压下电泳25－30min，随后15v/cm电压下电泳2－2.5h)，测定其分子量大小，发现其分子量与穿透素PTX1的分子量吻合(参见图1)。所述裂解液为终浓度的10mM NaH2PO4、10mM Tris和8M尿素,pH 8.0。所述TBSC缓冲液组成：50mM Tris-HCl,100mM NaCl,10mM Ca2+，pH 7.5。实施例2重组穿透素的抑菌应用步骤1)细菌悬液制备 在LB培养基中培养荧光假单胞菌至OD600为0.8,然后离心(5000g，4℃，10min)，收集菌体，将其悬浮于TBSC中至终浓度为104cfu/ml，即为荧光假单胞菌悬液。所述荧光假单胞菌保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC NO.2329，保藏日期2008.1.9，分类命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens),地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。步骤2)抑菌作用检测 将上述实施例1获得的重组穿透素蛋白在TBSC中稀释至200ug/ml，即为穿透素稀释液。将穿透素稀释液与上述步骤1)的细菌悬液或TBSC(对照)等体积(1：1)混合。将混合液25℃温育4h，随后取100ul混合液涂布于LB平板，28℃温育48h。计算平板上出现的细菌数。结果表明，穿透素组平板上的细菌数(1.1×104)显著(P<0.01)低于对照组平板上的细菌数(2.4×104)。这些结果表明，本专利技术的穿透素能够显著抑制细菌生长。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鱼类穿透素的应用，其特征在于：鱼类穿透素在制备抑菌制剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种鱼类穿透素的应用，其特征在于：鱼类穿透素在制备抑菌制剂中的应用。2.按权利要求1所述的鱼类穿透素的应用，其特征在于：所述鱼类穿透素在制备抑制荧光假单胞菌的抑菌制剂中的应用。3.按权利要求1或2所述的鱼类穿透素的应用，其特征在于：所述穿透素为穿透素重组蛋白。4.按权利要求3所述的鱼类穿透素的应用，其特征在于：所述穿透...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙黎，王婷，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37