本发明专利技术公开了一种双光子荧光探针及其制备方法和用途，其中双光子荧光探针是以咔唑作为母体，结构如下：本发明专利技术双光子荧光探针分子在三价金离子(Au3+)与其他干扰试剂共存的体系中，表现出专一性响应和高的灵敏度。细胞毒性测试表明该探针对于细胞几乎没有什么毒副作用，双光子共聚焦荧光显微成像实验表明该探针对HeLa细胞渗透性好，适用于细胞线粒体内Au3+的双光子荧光成像和定性检测。
【技术实现步骤摘要】
一、
本专利技术涉及一种双光子荧光探针及其制备方法和用途，以实现双光子成像定性检测细胞线粒体内的Au3+，具有选择性专一、灵敏度高、检测浓度低的优点。二、
技术介绍
近年来，由于金的生物适应性，功能性金纳米粒子多用作药物、基因传输、生物传感器和生物成像的材料。尽管金很稳定且有很好的生物兼容性，而且以其离子形式(Au+和Au3+)为基础合成的药物可用于治疗类风湿性关节炎、肺结核和癌症、哮喘以及疟疾等疾病，但金元素的毒理作用还是应该受到重视。金的离子形式对人体有潜在的毒理作用，特别是Au3+能引起生物体系严重中毒，因为它能结合DNA和神经系统，甚至能引起DNA链断裂。因此制得能快速检测环境和生物样本中Au3+的检测体系是一项重要的课题。线粒体是哺乳动物细胞中至关重要的一个细胞器，它在细胞凋亡的调控中(细胞程序性死亡)和某些疾病如癌症细胞凋亡异常反应特征中起重要作用，使其成为颇具吸引力的新抗癌药物的设计目标。由于线粒体高膜电位的驱动，亲脂性的金复合物会聚集在细胞内的线粒体内，几类基于金的化合物(包括Au+和Au3+的配合物)作为潜在的抗肿瘤剂引起关注，并已证明涉及线粒体细胞凋亡通路。基于金物种线粒体靶向药物的广泛应用，发展高效检测线粒体内金物种的方法很有必要，而且这对监测线粒体中金介导的生理过程和提高药物在生物医学的发展非常重要。荧光化学探针由于具有灵敏度高、选择性好、易合成、廉价以及良好的生物应用等特点，已成为生命科学和环境科学中主要的检测工具。目前，大部分检测细胞中Au3+的荧光探针均为单光子荧光探针，单光子荧光探针一般具有自荧光干扰大，激发波长小导致对细胞的光毒性大，容易发生荧光自淬灭等缺点。与单光子荧光探针相比，双光子荧光探针具有很多明显的优点，如：细胞光毒性小，不会引起荧光自淬灭，时间空间分辨率高，组织渗透深度大。因而双光子荧光探针已经作为科学家们研究的一个重要课题。咔唑作为一种经典的荧光团，不仅具有大的共轭体系和共平面性能，而且具有良好的光稳定性、低毒性。以咔唑为荧光团的单光子荧光探针已经被很多文献所报道，但是作为双光子荧光探针的文献报道相对较少。几乎没有关于专一检测细胞中线粒体内的Au3+的双光子荧光探针的报道。三、
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种双光子荧光探针及其制备方法和用途，所要解决的技术问题是通过分子设计得到一种合适的荧光探针结构，以实现双光子成像定性检测细胞线粒体内的Au3+，
具有选择性专一、灵敏度高、检测浓度低的优点，细胞毒性测试表明本专利技术荧光探针对细胞几乎没有毒性作用。本专利技术双光子荧光探针，简记为PyCM-3，以咔唑为母体，其结构式如下：本专利技术双光子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：在圆底烧瓶内加入9-乙基-6-(4’-(1’-甲基碘化吡啶)乙烯)-3-甲酰基咔唑(1)(0.1171g，0.25mmol)和无水甲醇12mL，于70℃搅拌使其溶解，滴加3滴冰醋酸，再滴加0.0413g(0.25mmol)2-肼基-苯并噻唑的无水甲醇溶液(8mL)，滴完后于70℃回流反应4h(TLC跟踪反应)，反应结束后冷却至室温，静置，析出晶体，过滤，用无水甲醇洗涤3次，再用无水甲醇重结晶得目标化合物PyCM-3，为棕红色片状固体，0.1188g，收率75％。本专利技术双光子荧光探针PyCM-3的合成过程如下：本专利技术双光子荧光探针在定性检测细胞中线粒体内的Au3+时作为检测试剂使用，检测方法如下：将本专利技术双光子荧光探针溶于DMSO中制得1mM的母液，取100μL的该母液于10mL容量瓶中，再用EtOH定容，配制成10μM的检测试剂。检测试剂分别在344nm和440nm有吸收峰；加入8倍当量的Au3+后，PyCM-3位于344nm的吸收峰消失，且在420nm出现一个新的吸收峰(图2)。10μM检测试剂加入8倍当量的各种金属离子、阴离子、活性氧物种和氨基酸后(图3a)，检测445-750nm范围内的荧光光谱变化，可以看出PyCM-3仅对Au3+有明显的荧光增强现象，具有专一性响应；当随着Au3+(0-160μM)的不断加入，可以观察
到540nm处的荧光发射峰强度逐渐增强，在加入8倍当量的Au3+后，荧光强度趋于饱和。斯托克斯位移约为120nm(图3b)。10μM检测试剂在加入Au3+的浓度范围为0-5μM时，其荧光强度与Au3+的浓度之间有很好的线性关系，检测浓度低至6×10-9M(图4)。本专利技术双光子荧光探针结构简单，易于合成，利用Schiff base反应将作用位点和荧光基团通过C＝N键连接为一整体。本专利技术双光子荧光探针与Au3+有明确的作用位点，通过荧光探针分子上的氮/硫配位原子先与Au3+快速配位，然后诱导荧光探针分子上的C＝N发生水解生成化合物1(图1)。本专利技术双光子荧光探针以荧光强弱的变化来检测Au3+，与Au3+作用后，在紫外灯下，肉眼就可以看出其荧光变化，荧光颜色和强度从无变成强的黄绿色光，操作简单，快速灵敏。本专利技术双光子荧光探针对Au3+具有专一性荧光响应，灵敏度高，检测浓度低。四、附图说明图1是本专利技术荧光探针分子(PyCM-3)与Au3+反应机理图。图2是10μM探针加入8倍当量的Au3+前后的紫外吸收光谱图。图3是10μM探针加入8倍当量的各种金属离子、阴离子、活性氧物种和氨基酸前后的荧光光谱图(3a)。10μM探针加入Au3+(0-160μM)的荧光滴定光谱图(3b)，3b插图是荧光最大发射峰强度与Au3+浓度之间的散点图。图4是10μM探针在加入Au3+(0-5μM)后的荧光强度与浓度的线性关系图。图5是10μM探针加入8倍当量的Au3+后的双光子吸收截面数值(5a)和10μM探针加入Au3+(0-80μM)的双光子荧光滴定谱图(5b)。图6是在不同含量(5μM、10μM、20μM、30μM)的探针分子的作用下的HeLa细胞存活率图。图7是10μM探针分子在HeLa细胞中加入80μM Au3+前后的双光子荧光共聚焦成像照片。PyCM-3(10μM)在HeLa细胞中培养30分钟后，用PBS缓冲液(pH7.4)冲洗；然后向上述含荧光探针的细胞培养液中加入80μM的Au3+，继续培养30分钟后用PBS缓冲液(pH7.4)冲洗。激发波长为860nm，荧光发射收集范围为520-560nm。图a是细胞中只加10μM探针PyCM-3的双光子荧光共聚焦成像，图d是10μM探针分子在HeLa细胞中加入80μM Au3+的双光子荧光共聚焦成像，图b、e是HeLa细胞的明场，图c是a、b的叠加，图f是d、e的叠加。图8是10μM探针分子在HeLa细胞中加入80μM Au3+后的线粒体定位成像照片。其中绿色通道tracker1，激发波长为860nm，发射波段为520-560nm，这个通道用来接受探针分子PyCM-3加入Au3+后发射的荧光。红色通道tracker2，激发波长为579nm，发射波长为579-619nm，这个通道用来接收商品化线粒体染色剂Mitochondria@Tracker Red FM发射的荧
光。图a，b分别为红色通道和绿色通道下的荧光共聚焦成像。图d是HeLa细胞的明场，图c是a、b、d的叠加，图e是图c中单个细胞的荧光强度剖面图，图f是P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双光子荧光探针，其特征在于其结构式为：
【技术特征摘要】
1.一种双光子荧光探针，其特征在于其结构式为：2.一种权利要求1所述的双光子荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：在圆底烧瓶内加入9-乙基-6-(4’-(1’-甲基碘化吡啶)乙烯)-3-甲酰基咔唑0.25mmol和无水甲醇，于70℃搅拌使其溶解，滴加3滴冰醋酸，再滴加0.25mmo...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯燕，王文娟，王奇，孟祥明，朱满洲，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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