一种Her2特异性嵌合抗原受体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种Her2特异性嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由人抗Her2单链抗体，人IgG1分子FC区的CH2CH3，CD28的胞内区，CD137的胞内区，及CD3ζ的胞内区串联构成。本发明专利技术还公开了上述Her2特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列和核酸序列。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的淋巴细胞可用于Her2基因表达相关肿瘤的治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞免疫
，尤其涉及一种Her2特异性嵌合抗原受体及其应用。
技术介绍
在肿瘤治疗领域经历了手术、化疗、放疗等多种治疗手段的革新，但这些方法对许多肿瘤的治疗效果仍然十分有限。随着医学免疫学与分子生物学的发展，产生了过继细胞免疫治疗(ACI)方法，经过研究的不断深入，ACI逐步走向临床，给癌症患者带来新的希望。其中嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)技术以其诸多优势在近五年成为细胞免疫治疗领域的热点。嵌合抗原受体主要由胞外区、跨膜区和胞内信号转导区组成。胞外区常由针对特异性抗原的单链抗体重链可变区和轻链可变区通过特殊Linker连接而成，具备识别特异性抗原的功能；跨膜序列可以是CD3ζ、CD8，FcεRIγ等，其结能影响CAR在T细胞内的表达；胞内区承担信号传导的功能，其共刺激分子可以是CD28、CD134、CD137、CD244等。将嵌合抗原受体的基因通过基因转导技术重组到T淋巴细胞基因组，获得的CAR-T细胞即能表达该嵌合抗原受体，从而将T细胞以非MHC限制性方式靶向含有特异性抗原的肿瘤细胞，产生杀瘤作用。CAR-T细胞用于治疗相关肿瘤，T细胞可由表面嵌合抗原受体与肿瘤表面特异性抗原结合而激活并释放各种细胞因子杀伤肿瘤细胞。肿瘤细胞表面的蛋白质、糖、糖脂都可以作为嵌合抗原受体的潜在靶点，使得CAR-T拥有更广泛的抗原谱。另外，CAR结构中的协同共刺激分子可以提高T细胞增值活性、体内存在时间，从而使CAR-T细胞获得持久的杀瘤作用。目前ACI主要有NK细胞，DC-CIK、CAR-T细胞等。NK细胞是机体天然免疫的主要承担者，可直接杀伤肿瘤细胞，但是其在体外扩增效率低，细胞毒活性不理想，限制了其临床疗效。CIK细胞是多种细胞因子刺激后获得的具有免疫活性的异质细胞群，DC细胞是目前发现的功能最强大的抗原提呈细胞。CIK细胞因没有特异性杀瘤作用，在临床上疗效有限，而DC-CIK技术使得CIK细胞获得特异性杀瘤作用，但是DC细胞在外周血中不易获取且制备困难，限制了它的应用。人类表皮生长因子受体2(human epidermalgrowth factor receptor-2，Her2)基因，即c-erbB-2基因，是具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体样蛋白，通过与所在受体家族相关成员相互作用以及与配体的结合激活信号通路，调节细胞的生长、分化与增值。Her2基因产物正常表达于分泌腺上皮细胞，当其基因拷贝异常增加，将会驱动所在细胞的恶变及扩增。在临床上，Her2是重要的乳腺癌预后判断因子，与乳腺癌的扩散转移密切相关。据统计，乳腺癌患者中，约20～30％的患者为Her2阳性。相比Her2阴性的乳腺癌，Her2阳性的乳腺癌侵袭性强，复发、转移风险高，激素治疗和常规治疗反应差，预后不良，给患者带来沉重的打击。研究还发现，Her2除了参与乳腺癌的发生发展外其过表达还在胃癌、结肠癌、膀胱癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、食管癌等多种形式的癌症中发生。
技术实现思路
基于
技术介绍
存在的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种Her2特异性嵌合抗原受体。本专利技术的目的还在于提供上述嵌合抗原受体的氨基酸序列和核酸序列。本专利技术的目的还在于提供上述嵌合抗原受体的应用。为了实现上述目的，本专利技术提出的一种Her2特异性嵌合抗原受体，所述嵌
合抗原受体由人抗Her2单链抗体，人IgG1分子FC区的CH2CH3，CD28的胞内区，CD137的胞内区，及CD3ζ的胞内区串联构成。优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。优选地，所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。优选地，所述人抗Her2单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。优选地，所述人抗Her2单链抗体的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。优选地，所述人抗Her2单链抗体的重链分子和轻链分子之间有一个连接肽，其氨基酸序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。优选地，人IgG1分子FC区的CH2CH3，CD28的胞内区，CD137的胞内区，及CD3ζ的胞内区串联构成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。优选地，所述信号传导结构域的核酸序列如SEQ ID NO.6所示。本专利技术还提出的上述Her2特异性嵌合抗原受体在制备嵌合抗原受体T淋巴细胞及治疗Her2相关肿瘤药物中的应用。本专利技术提供所述人抗Her2嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞制备方法具体过程如下：本专利技术根据本实验室噬菌体展示技术筛选到的人抗Her2Fab序列，将其进行密码子优化，在5’端加上信号肽，全基因合成嵌合抗原受体Her2-scFv-CH2CH3-CD3ζ-CD28-CD137，并将合成的ScFv序列克隆到pUC57载体中，构建出抗人Her2-CAR表达质粒。再通过Gateway重组克隆技术将合成的CD137片段克隆到Her2-ScFv-CH2CH3-CD28-CD3ζ中，即获得本专利技术的嵌合抗原受体Her2-ScFv-CH2CH3-CD28-CD137-CD3ζ。利用该嵌合抗原受体与逆转录病毒的包装质粒RD114 env在GP293T细胞
中对病毒进行包装，利用此逆转录病毒感染T淋巴细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。将获得的CAR-T细胞在体外与肿瘤细胞共培养，通过流式细胞术检测CAR-T细胞表面抗原表达情况，CCK8法检测该CAR-T细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤活性，以证实该嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞对肿瘤的特异性杀伤作用。因此本专利技术所述的嵌合抗原受体Her2-ScFv-CH2CH3-CD28-CD137-CD3ζ可以在相关肿瘤治疗中得到应用。本专利技术提供的嵌合抗原受体Her2-ScFv-CH2CH3-CD28-CD137-CD3ζ是通过逆转录病毒技术制备的逆转录病毒，可体外感染T淋巴细胞，所获得的CAR-T细胞可以通过CAR的单链抗体部分特异性识别表达Her2的肿瘤细胞，同时激活CAR-T细胞，使其释放IFN-γ、TNF等多种细胞因子杀伤肿瘤细胞。采用CAR技术制备的CAR-T具有制备周期短，重复性好，可以用于Her2相关肿瘤的治疗，制备Her2相关肿瘤的抗肿瘤药物。附图说明图1为本专利技术实施例1所得Her2-scFv目的片段的电泳图，其中1为DL2000核酸分子量标准，2为Her2-scFv目的片段。图2为本专利技术实施例1所得CD8a-CD137-CD3ζ目的片段的电泳图，其中1为Her-2-ScFv-CH2CH3-CD28-CD137-CD3ζ，2为CAR载体经NcoI和BamHI酶切释放的pUC57载体，3为未酶切的CAR载体；4为DL10000kD核酸分子量标准。图3为本专利技术实施例2中采用Western Blotting检测本专利技术所得Her2特异性嵌合抗原受体转染293T细胞后的表达，其中1为转染逆转录病毒CD19 CAR质粒的293T细胞，2为转染逆转录病毒c-Met CAR质粒的293T细胞，3为作为对照的未转染293T细胞。图4为Western Blotting检测不同的对数生长期肿瘤细胞中H本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Her2特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由人抗Her2单链抗体，人IgG1分子FC区的CH2CH3，CD28的胞内区，CD137的胞内区，及CD3ζ的胞内区串联构成。

【技术特征摘要】
1.一种Her2特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由人抗Her2单链抗体，人IgG1分子FC区的CH2CH3，CD28的胞内区，CD137的胞内区，及CD3ζ的胞内区串联构成。2.根据权利要求1所述Her2特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1或2所述Her2特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求1-3任一项所述Her2特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述人抗Her2单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。5.根据权利要求1-4任一项所述Her2特异性嵌合抗原受体，其特征在于，所述人抗Her2单链抗体的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。6.根据权利要求1-...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯振卿，朱进，许国贞，刘振云，唐奇，唐小军，黄骁辰，
申请(专利权)人：安徽未名细胞治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34