本发明专利技术公开了一种使用CAPS标记检测与千粒重相关的小麦胞质型腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因（TaAGPS）优异等位变异的方法。本发明专利技术中两种等位变异（TaAGPS‑7A‑T和TaAGPS‑7A‑G）在TaAGPS‑7A外显子区5092位对应的碱基分别为T和G，其相应的氨基酸为丝氨酸（Ser）和丙氨酸（Ala），首先利用引物对SEQ ID No：1和SEQ ID No：2进行PCR扩增，经DdeI内切酶进行酶切后电泳检测，可以方便有效地实现TaAGPS基因不同等位变异在小麦种质资源以及育种后代中的鉴定。本发明专利技术通过常规的PCR和琼脂糖凝胶电泳的方法就可以完成，操作方便，且稳定可行。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体是关于一种使用CAPS（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）标记检测与千粒重相关的TaAGPS基因优良等位变异的方法。
技术介绍
小麦的基因组为异源六倍体，由A、B和D三个同源性极高的基因组组成，基因组庞大且复杂，这为小麦遗传育种研究的发展提供了挑战。小麦是世界上最重要的粮食作物之一，在全球各地广泛种植。Rajaram等研究表明：随着世界人口的增加，预计全球对小麦的需求量将在2020年进一步增长40%，因此培育高产的小麦品种成为当前育种家的主要育种目标之一。小麦的产量由小穗数、穗粒数和千粒重等三要素构成，中国小麦产量的提高主要是依靠增加穗粒数和千粒重（王兰芬等）；而淀粉占小麦籽粒干重的65-75%，淀粉合成的量及所占比例显著影响小麦千粒重，从而影响小麦产量。淀粉的合成是一个复杂的过程，目前已经确认参与胚乳淀粉合成的酶主要由六种，包括腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、颗粒结合型淀粉合成酶（GBSS）、可溶性淀粉合成酶（SS）、分支酶（BE）、去分支酶（DBE）和葡萄糖-6磷酸转移酶（GPT1）等。由于这些酶的相互作用，保证了植物体合成新的淀粉从而满足自身需求，其中AGPase在高等植物中催化1-磷酸葡萄糖（G-1-P）与腺苷三磷酸（ATP）形成腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）和焦磷酸（PPi），而ADPG是直链和支链淀粉合成的底物，同时其浓度直接影响淀粉合成的速率和效率，因此AGPase是小麦、水稻和玉米等高等植物中淀粉合成途径中的关键酶。王月福等研究表明AGPase的活性变化与籽粒灌浆速率和淀粉含量的积累呈显著地正相关。Smidansky等人将含有特异位点突变的玉米AGPase基因转入小麦中，能够显著增加籽粒的重量及其淀粉含量；但如果该基因发生突变或进行人工敲除，则该酶的活性会随之降低或消失，从而抑制淀粉的合成。小麦等禾本科作物中的AGPase是由两个大亚基和两个小亚基组成的异源四聚体，根据其在胚乳细胞内的分布，可分为胞质型和质体型两种，因此AGPase存在着四种亚基，包括胞质型小亚基、质体型小亚基、胞质型大亚基和质体型大亚基。有研究表明AGPase小亚基保守型相对较高，且同时具有催化活性和调节活性，对淀粉的合成起关键作用，而胞质型的AGPase占总酶活性的65-95%，因此胞质型的AGPase小亚基在淀粉合成中尤为重要。Yano等研究表明水稻AGPS2基因的突变导致AGPase酶活性降低和胚乳淀粉积累减少，Ventriglia等分析拟南芥中AGPase小亚基(APS1）的T-DNA插入突变体aps1发现AGPase活性完全缺失，且叶片中瞬时淀粉的合成量几乎没有。因此在小麦中研究胞质型AGPase小亚基（TaAGPS）显得尤为重要，但到目前为止，在小麦中对于TaAGPS基因的优良等位变异筛选及其分子标记几乎没有报道，这极大阻碍了小麦淀粉合成关键基因AGPase在小麦产量性状改良中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决普通小麦中胞质型AGPase小亚基基因（TaAGPS）的优良等位变异检测的技术问题，提供了一种检测小麦TaAGPS基因优良等位变异的方法并可直接用于产量改良中对优良等位基因的选择。本专利技术所提供的技术方案是：一种检测小麦中与千粒重相关的胞质型AGPS小亚基基因等位变异的引物对，所述引物对为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2。本专利技术人根据TaAGPS基因的基因组序列，在外显子区和外显子区的保守序列位置设计引物对，外显子区和外显子区之间的序列在不同小麦材料的基因间存在多态性，所述引物对中的一条引物序列位于所述外显子区中，所述引物对的另一条引物序列位于所述外显子区中。本专利技术还提供一种小麦中辅助检测与千粒重相关的胞质型AGPase小亚基基因等位变异的方法，包括如下步骤：1） 用所述的引物对对待测材料进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；2）用限制性内切酶DdeI对步骤1）得到的PCR扩增产物进行酶切，从而得到酶切产物；3）检测所述酶切产物的多态性，其中对于TaAGPS-7A-T等位变异类型，经酶切后产生234bp和402bp的两个短片段，而对于TaAGPS-7A-G等位变异类型，则没有短片段产生。所述的方法，采用琼脂糖凝胶中电泳后，根据有无234bp和402bp的短片段的条带有无来区分TaAGPS-7A-G和TaAGPS-7A-T两种等位变异。上述方法中，所述AGPase为小麦腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶。上述方法中，所述TaAGPS基因为小麦胞质型腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因。上述方法中，所述多态性为234bp和402bp两个短片段的有无。上述方法中，所述外显子区和外显子区之间的序列是具有单碱基差异序列。上述方法中，所述根据酶切产物的多态性确定所述待测材料中待测TaAGPS基因的等位变异的方法为：将所述PCR扩增产物经DdeI内切酶酶切后分析是否能产生234bp和402bp两个短片段（即新的短片段的有无分别对应不同的等位变异类型）。本专利技术还提供所述的引物，或所述的方法在小麦培育中的应用：培育高千粒重的小麦品种，筛选具有TaAGPS-7A-G等位变异类型的品种。所述的应用是在筛选高千粒重小麦和低千粒重的小麦中的应用。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术为解决普通小麦胞质型AGPase小亚基基因（TaAGPS）的优良等位变异检测的技术问题，提供一种检测方法，有助于快速有效地鉴定小麦TaAGPS基因等位变异类型及应用于分子标记辅助育种。该方法基于普通小麦品种中TaAGPS基因的特点：在外显子区域设计特异的PCR引物，通过PCR的方法扩增得到TaGAPS基因的DNA片段，将所述PCR扩增产物经DdeI内切酶酶切后得到酶切产物，通过一定的鉴定方法（琼脂糖凝胶电泳）来检测这些酶切产物之间的多态性，进而可以达到鉴定一个小麦品种中TaAGPS基因等位变异的目的。应用该策略可以建立分子标记检测体系，对TaAGPS基因的优良等位变异进行有效的分离鉴定，也可以对构建的近等基因系或重组自交系群体材料的TaAGPS基因的等位变异类型进行鉴定；这种分子标记体系构建策略也可以进一步推广到对具有类似序列特征功能基因的等位变异的分离鉴定。本专利技术方法中，根据实验室前期研究的结果以及Genbank中的TaAGPS基因序列所设计的引物，用保守引物进行TaAGPS基因分离鉴定的验证试验证明了该引物的保守性和有效性，也表明了该分子标记体系的准确性和可靠性。本专利技术方法无需昂贵的仪器和试剂，通过常规的PCR仪和琼脂糖凝胶电泳仪就可以完成，易于操作。本专利技术方法基于DdeI内切酶可以识别特异碱基位点（CTNAG），并进行切割，通过琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行片段分型，可以有效分离并准确鉴定TaAGPS基因不同的等位变异。在本专利技术方法中，通过一次PCR反应和一次酶切反应就可以检测一个小麦品种中TaAGPS基因的等位变异类型，而且PCR仪和琼脂糖凝胶电泳仪都是自动化和高通量的仪器。本专利技术方法极大地提高了TaAGPS基因鉴定的效率和准确性。本专利技术的基于CAPS分子标记构建策略，不仅适用于TaAGPS基因分子标记检测体系的构建，同样适用于序列中含有特异本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测小麦中与千粒重相关的胞质型AGPS小亚基基因等位变异的引物对，其特征在于，所述引物对为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2。
【技术特征摘要】
1.一种检测小麦中与千粒重相关的胞质型AGPS小亚基基因等位变异的引物对，其特征在于，所述引物对为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2。2.一种小麦中辅助检测与千粒重相关的胞质型AGPase小亚基基因等位变异的方法，包括如下步骤：1） 权利要求1所述的引物对对待测材料进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；2）用限制性内切酶DdeI对步骤1）得到的PCR扩增产物进行酶切，从而得到酶切产物；3）检测所述酶切产物的多态性，其中对于TaAGPS-7A-T等位变异类型，经酶切后产生234bp和402b...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘冬成，张爱民，马晓玲，阳文龙，孙家柱，余慷，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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