布鲁氏菌多表位融合蛋白疫苗的制备及应用制造技术

本发明专利技术公开了布鲁氏菌多表位融合蛋白抗原，是将布鲁氏菌外膜蛋白BP26、OMP31、OMP16、OMP2b优势抗原表位的氨基酸序列进行串联，构建了融合蛋白基因，表达了蛋白，制备了布鲁氏菌多表位融合蛋白抗原疫苗。小鼠攻毒实验表明对布鲁氏菌感染具有免疫保护性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学技术和免疫学领域。具体涉及一种布鲁氏菌多表位融合蛋白抗原及其在制备布鲁氏菌病苗方面的应用。
技术介绍
近年来，随着经济全球化的快速发展，新的传染病不断发生，一些旧的传染病也开始死灰复燃，尤其是对人类危害较为严重的布鲁氏菌病，近几年发病率呈逐年增加的趋势，给世界各国带来巨大的公共卫生问题和经济损失。布鲁氏菌病是由布鲁氏菌侵入机体引起的一种人兽共患传染病。人群感染布鲁氏菌后可引起发热、多汗、乏力、游走性关节痛等全身性症状，严重者出现肝脾及睾丸肿大，关节变形，最终丧失劳动能力和生育能力；动物在感染布鲁氏菌后，公畜会出现睾丸肿大，影响繁殖和配种，母畜可能出现流产、早产，而且流产胎儿、胎衣、阴道分泌物等含有大量的细菌，如果不及时消毒，还可能引起同群动物感染或者感染人类。布鲁氏菌进入机体后主要在细胞内寄生，并进行繁殖，因此，一般药物很难发挥药效，且复发率很高，目前没有理想的治疗布鲁氏菌病药物，疫苗预防是防控该病的最为有效的手段。目前布鲁氏菌疫苗种类较多，主要包括弱毒活疫苗、灭活疫苗、突变株疫苗、DNA疫苗等[1]。由于这些疫苗都存在着动物流产、免疫效果不好等缺点，目前为止还没有特别理想的布鲁氏菌疫苗应用于布鲁氏病的防控。因此研制新型、有效疫苗是目前防控布鲁氏病的研究热点。基因工程亚单位疫苗和融合蛋白疫苗是布鲁氏菌病疫苗研究的一个重要的方向，其原理是用DNA重组技术，将编码病原微生物特异性抗原表位的基因导入工程菌(受体菌)或细胞，使其在受体细胞中高效表达出来，然后加入免疫佐剂后制成疫苗，其优点在于能够延长保护期限、不会出现减毒活疫苗转变致病力而导致人或动物致病、防止动物出现流产、稳定性好等。因此，本研究拟利用生物信息学技术预测布鲁氏菌主要保护性抗原的B细胞、T细胞优势抗原表位，利用免疫学技术筛选理想的表位，再利用融合蛋白技术将优势表位进行串联制备出具有自主创新性的、免疫原性好的新型疫苗，为布鲁氏菌病的预防和控制提供良好的手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是，提供一种布鲁氏菌多表位融合蛋白抗原。布鲁氏菌多表位融合蛋白抗原，它的氨基酸序如序列表SQ ID No.1所示。布鲁氏菌多表位融合蛋白抗原，它的碱基序如序列表SQ ID No.2所示。布鲁氏菌多表位融合蛋白抗原疫苗，它是权利要求1所述的布鲁氏菌多表位融合蛋白抗原。本专利技术提供了布鲁氏菌多表位融合蛋白抗原，是将布鲁氏菌外膜蛋白BP26、OMP31、OMP16、OMP2b优势抗原表位的氨基酸序列进行串联，构建了融合蛋白基因，表达了蛋白，制备了布鲁氏菌多表位融合蛋白抗原疫苗。小鼠攻毒实验表明对布鲁氏菌感染具有免疫保护性。附图说明 图1布鲁氏菌rMEP表达及定位（M：蛋白Marker； 1：诱导前；2：37℃诱导4h的上清；3：37℃诱导4h的沉淀）；图2布鲁氏菌rMEP镍琼脂糖亲和层析SDS-PAGE结果（M：Protein marker；1：上样；2：流出；3: 10mmol/L Imidazole洗脱组分；4：20 mmol/L Imidazole洗脱组分；5-8：50 mmol/L Imidazole洗脱组分；9：500 mmol/L Imidazole洗脱组分）；图3布鲁氏菌rMEP阴离子交换层析SDS-PAGE结果（M：Protein marker；1：上样；2：流出；3: 50 mmol/L NaCl洗脱组分；4-7：100 mmol/L NaCl洗脱组分；8-10：150 mmol/L NaCl洗脱组分；11：200 mmol/L NaCl洗脱组分；12：300 mmol/L NaCl洗脱组分；13：1 mol/L NaCl洗脱组分）；图4布鲁菌rMEP表达SDS-PAGE鉴定结果（M为蛋白质Marker； 1为布鲁菌多表位融合蛋白）；图5布鲁菌rMEP表达Western Blot鉴定结果（M为蛋白质Marker； 1为布鲁菌多表位融合蛋白）；图6三组小鼠血清中特异性抗体水平测定结果；图7 三组小鼠血清中特异性抗体亚型测定结果；图8 三组小鼠脾细胞培养上清液中细胞因子IFN- γ和IL-6测定；图9三组小鼠CTL活性检测结果；图10 三组小鼠T细胞亚型检测结果。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施中未注明具体条件的实验方案，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。实施例1 布鲁氏菌多表位融合基因的设计及质粒的构建从Pubmed数据库中调取布鲁氏菌优势外膜蛋白的氨基酸序列，采用BepiPred (http://www.cbs.dtu.dk/services/Bepipred/), ABCpred (http:// www. imtech. res. in/ raghava/abcpred/) 和COBEpro (http:// scratch. proteomics. ics. uci. edu/) 等软件对布鲁氏菌外膜蛋白的B细胞表位进行预测，采用IEDB (http:// tools. iedb.org/main/tcell/)网站的T细胞表位预测工具对T细胞表位进行预测，采用BLASTP analysis对抗原表位进行相似性分析，选择优势抗原表位，在相邻表位之间加入一段连接肽序列，采用DNA Star对抗原表位的串联顺序和连接肽的种类进行优化，选择免疫原性好的序列作为目的融合蛋白疫苗的氨基酸序列，用于下一步布鲁氏菌rMEP疫苗的表达及应用研究。采用DNAStar对所设计的布鲁氏菌rMEP疫苗的α螺旋、β折叠、柔性、亲水性、抗原性等免疫学参数进行预测，根据设计好的布鲁氏菌rMEP疫苗的氨基酸序列进行密码子优化后，人工合成或PCR方法构建融合蛋白基因序列如SEP ID NO.2所示，将所构建的融合蛋白基因连接于PET-28b载体的多克隆酶切位点处。上述步骤中的选取的优势外膜蛋白为布鲁氏菌BP26、OMP31、OMP16和OMP2b。上述步骤中的抗原表位见表1。上述连接肽序列Linker的编码 “GGGS”。实施例2 布鲁氏菌rMEP的表达表达宿主菌大肠杆菌BL21（DE3）菌种由吉林大学公共卫生学院卫生检验教研室保存；含布鲁氏菌rMEP疫苗碱基序列的表达载体pET-28b质粒由实施例1中所构建；各种分子生物学试剂均购于生物试剂公司。将实施例1中获得的pET-28b质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）表达菌，42℃热击90s，冰上静置2min后涂LA平板（含30μg/mL卡那霉素），37℃培养过夜。挑取表达菌株的单个菌落于4mL LB培养基（含30μg/mL卡那霉素）中，37℃，220r/min培养18~24h。取0.4mL培养物加入到4mL新鲜的LB培养基（含30μg/mL卡那霉素）中继续培养，当菌液的OD600达到0.6左右时，添加终浓度为0.5mmol/L的IPTG，37℃，220r/min 诱导4h，同时设定未添加IPTG诱导剂的作为阴性对照。12000r/min离心10min，收集菌体。采用SDS-PAGE检测布鲁氏菌rMEP疫苗的表达情况及定位，结果如附图1所示。结果显示宿主菌经诱导后在细菌沉淀与上清中均有目本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种布鲁氏菌病特异性融合蛋白抗原，它的氨基酸序如序列表SQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1. 一种布鲁氏菌病特异性融合蛋白抗原，它的氨基酸序如序列表SQ ID No.1所示。2. 一种布鲁氏菌病特异性融合蛋白抗原基因，它的碱基序如序列表SQ ID No.2所示。3. 一种原核表达载体，它是在含有T7启动子的原核融合蛋白表达载体中插入了如序列表SQ ID No.2所示的基因。4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐坤，李娟，李丽，殷德辉，宋秀玲，王娟，刘玉申，宋丹丹，曲笑锋，鞠文，赵超，庞博，孟祥君，张惠雯，翟玥，暴昊，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22