本发明专利技术属于抗体工程领域，具体涉及一株表达抗黄绿青霉素的基因工程单链抗体株及其应用。本发明专利技术通过琥珀酸酐法和碳二亚胺两步法合成人工完全抗原CIT‑BSA和CIT‑KLH，利用噬菌体展示技术，淘选出能稳定分泌表达抗黄绿青霉素CIT的基因工程单链抗体株，并通过构建原核表达载体表达纯化出具有功能的单链抗体，组装ELISA检测试剂盒，实现对农产品中残留的CIT毒素的定性与定量检测，为商品化的开发生产高质量的酶联免疫检测试剂盒和金标抗体检测卡奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于抗体工程领域，具体涉及一株表达抗黄绿青霉素的基因工程单链抗体株及其应用。
技术介绍
黄绿青霉素（Citreoviridin, CIT）是一种具有毒性的小分子真菌毒素，主要由黄绿青霉菌（Penicillum citreoviridin, PCV）分泌产生的，广泛的存在于谷类农作物和农副产品中，主要生长在低温高湿度等的恶劣环境中，对人和动物体的健康有害。CIT作为一种小分子毒素，具有神经毒性作用，可抑制中枢神经系统，严重的甚至会引起死亡；同时它也具有心脏血管毒性作用，很多研究表明CIT是引起心脏性脚气病主要病因；还有研究报道CIT是导致克山病的可疑原因；该毒素在体外能抑制白色念球菌生长以及艾滋病病毒HIV-1活性；许多动物实验研究表明CIT可造成大鼠肝脏和心脏的损伤，其病理改变与克山病患者的心肌病变现象相似。目前，针对农产品中的黄绿青霉素检测技术普遍采用的是仪器分析法，主要包括薄层色谱法(Thin-layer chomatography techniques, TLC)、高效液相色谱法(High performance liquid chromatography, HPLC)。此外，紫外光谱技术(UV spectrum)、红外光谱技术(IR spectrum)、荧光检测技术(Fluorescence detection，FD)、液相-质谱联用(Liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)、气相-质谱联用(Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)等方法也被用于黄绿青霉素的实际样品检测。但是，上述的基于色谱和光谱检测技术检测灵敏度低，特异性差，检测耗时且对样品的纯度要求高，操作复杂、需要专业的检测机构和技术人员，因此不适合推广和用于实际样品的快速准确的检测。免疫分析法（immuno-analysis）方法是近十多年来发展起来的新方法，是将抗原抗体反应与灵敏的检测系统结合而成的一种分析方法，具有特异性好，灵敏度高，操作技术简单，成本低，对样品的纯度要求不高等优点，特别适合于大批量样本的检测，近年来被广泛普及应用于各种毒素的检测。黄绿青霉素广泛存在于低温高湿地区被污染的霉变谷类作物中，它污染粮食，饲料以及食品，导致人畜患病。由于CIT在农产品中残留危害大、检测困难、不易预防，尤其是对于农产品、质检商检和卫生防疫部门来说，更需要一个简便、快速、灵敏的方法对CIT进行检测。但目前为止，基于基因工程抗体的对CIT毒素进行免疫学检测方法的研究还没见报道。因此，制备针对CIT毒素的高亲和力特异性强的基因工程抗体并建立基于基因工程抗体的免疫学检测方法，为最终开发基于基因工程抗体的商品化检测试剂盒与胶体金检测卡奠定了基础，也为CIT毒素污染的预警和监控防范奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株能稳定表达高亲和力的抗CIT基因工程单链抗体株及其应用，制备针对CIT毒素的高亲和力特异性强的基因工程抗体并建立基于基因工程抗体的免疫学检测方法，为最终开发基于基因工程抗体的商品化检测试剂盒与胶体金检测卡奠定了基础，也为CIT毒素污染的预警和监控防范奠定了基础。本专利技术首先保护一株抗CIT毒素的基因工程单链抗体株大肠埃希氏菌（Escherichia coli）TG1/scFv-5A10，已于2016年3月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.12309，地址为北京朝阳区北辰西路1号院。其次保护一种有所述的单链抗体株TG1/5A10表达的单链抗体。所述的基因工程单链抗体的制备方法，是将噬菌体展示淘选得到的单链抗体基因扩增，克隆到原核表达载体中，并转化大肠杆菌BL21进行IPTG诱导表达纯化，获得的具有CIT抗原结合活性的单链抗体。本专利技术还保护了所述单链抗体的应用，是利用抗原抗体反应原理将产生的单链抗体用于在农产品中检测黄绿青霉素CIT。所述的单链抗体的应用，一是将所述的单链抗体配置在检测CIT的免疫检测试剂盒中。二是将所述的单链抗体制备成金标免疫检测试纸卡，并用于快速检测黄绿青霉素CIT。本专利技术的优点在于：本专利技术通过琥珀酸酐法和碳二亚胺两步法合成人工完全抗原CIT-BSA和CIT-KLH，利用噬菌体展示技术，淘选出能稳定分泌表达抗黄绿青霉素CIT的基因工程单链抗体株，并通过构建原核表达载体表达纯化出具有功能的单链抗体，组装ELISA检测试剂盒，实现对农产品中残留的CIT毒素的定性与定量检测，为商品化的开发生产高质量的酶联免疫检测试剂盒和金标抗体检测卡奠定了基础。附图说明图1是本专利技术中淘选得到的单链抗体株的ELISA检测结果。图2是本专利技术单链抗体株PCR鉴定结果。图3是本专利技术单链抗体株DNA序列分析结果。图4是本专利技术单链抗体原核表达纯化结果。图5是本专利技术单链抗体western blot检测结果。图6是本专利技术单链抗体亲和力检测结果。图7是本专利技术单链抗体特异性检测结果。具体实施方式实施例1 本专利技术单链抗体的制备与鉴定。1、黄绿青霉素人工完全抗原的制备本实验将黄绿青霉素（CIT）分别与载体蛋白BSA和KLH进行交联形成具有免疫原性的人工完全抗原CIT-BSA和CIT-KLH。整个交联过程分两步进行，第一步，用琥珀酸酐法将黄绿青霉素分子3位上的羟基改造成羧基；第二步，用碳二亚胺法将改造后生成的羧基与载体蛋白的氨基脱水缩合连接在一起。具体步骤如下：（1）称取琥珀酸酐粉末60 mg溶于500 μL无水吡啶中，同时加等物质的量的1 mol/L DMAP，65℃烘箱中预热30~60 min，活化琥珀酸酐。（2）将琥珀酸酐溶液直接加入1 mg的CIT固体中，使其充分溶解，然后用封口膜封口，放在65℃条件下，反应7 h（将反应进行到3 h时，再添加琥珀酸酐颗粒20 mg）。（3）反应终止后，直接将反应产物放到4℃冰柜放置过夜。（4）次日，将其反应物取出在室温平衡30~60 min后，对产物进行旋转蒸发干燥处理，主要是去除无水吡啶，防止其对后续反应的影响。（5）用 EDC 法进行第二步反应：第一步的反应中间产物理论值是1.25 mg，将其溶解在600 μL（DMF: 水= 6: 9）的溶液中，加入12.5 mg EDC，避光混匀30 min。（6）再加入0.5% KLH（碳酸盐缓冲液（0.05 mol/L pH 9.6）1 mL，KLH标准品5 mg，先将其在漩涡仪上振荡混匀，在12000 r/min，离心5 min），在低温摇床上25℃避光反应2 h，100 r/min；然后再补加 EDC 12.5 mg，继续低温摇床上25℃避光反应4 h，结束反应。（7） 用1×PBS，pH 7.2 在4℃冰柜透析3 d，每天换液两次，将未反应完全的CIT透析掉。3 d后吸出透析液，分装-20℃保存。CIT-BSA交联方法与上面类似，只是用0.013 mol/L NaHCO3溶液去活化BSA标准品。2、基因工程单链抗体的制备。1）、动物免疫将制备的完全抗原用于免疫6只雌Balb/c小鼠，免疫取50 μg的蛋白抗原溶解在100 μL的1×PBS缓冲液中，然后与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化完全本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株表达抗黄绿青霉素的基因工程单链抗体株，其特征在于：所述基因工程单链抗体株为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）TG1/scFv‑5A10，已于2016年3月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.12309。
【技术特征摘要】
1.一株表达抗黄绿青霉素的基因工程单链抗体株，其特征在于：所述基因工程单链抗体株为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）TG1/scFv-5A10，已于2016年3月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.12309。2.一种由权利要求1 所述基因工程单链抗体株产生的单链抗体。3.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：王荣智，汪世华，顾小松，杨航，钟燕芳，凌素美，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。