一种同步定量检测不同分子形式人中性粒细胞脂质运载蛋白免疫层析装置及其制备方法制造方法及图纸

一种同步定量检测不同分子形式人中性粒细胞脂质运载蛋白(HNL)免疫层析装置及其制备方法，属于检验医学领域。由样品稀释液冻干粉、标准品冻干粉及免疫层析试纸条组成；所述免疫层析试纸条由衬板、两层滤血膜、样品流动垫、UCP结合垫、分析膜和吸收垫组成。所述UCP结合垫包被UCP标记的抗三种分子形式HNL抗体；所述分析膜上设有平行的三个检测区T1、T2、T3和一个质控区C，所述三个检测区依次包被抗基质金属蛋白酶‑9抗体、抗单体HNL抗体和抗同二聚体HNL抗体；质控区C包被抗UCP标记抗体来源动物免疫球蛋白的抗体。本发明专利技术使同一样品在同一试纸条上联合检测三种分子形式HNL，具快速、定量、简便等优点，具有较大科研和临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于临床检验医学
，具体涉及一种同步联合定量检测不同分子形式人中性粒细胞脂质运载蛋白(HNL)的免疫层析装置及其制备方法。
技术介绍
人中性粒细胞脂质运载蛋白(human neutrophil lipocalin,HNL)最初是由Xu S.等人(Scand.J.Clin.Lab Invest 54,365-376)在中性粒细胞颗粒中发现的一种糖蛋白，属于脂质运载蛋白(lipocalin)超家族成员，和其他脂质运载蛋白具有相似的空间结构。该蛋白也称中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinaseassociated lipocalin，NGAL),又称人脂质运载蛋白2(lipocalin 2)等。蔡林君等人(Clin.J.Am.Soc.Nephrol.2010,5:2229-35)研究发现尿HNL以多种分子形式存在，有单体(约25kDa)、同二聚体(约45kDa)以及与明胶酶(gelatinase)形成的异二聚体(约135kDa)。除中性粒细胞能分泌HNL外，在生理或病理(如炎症、感染、肿瘤、缺血等)条件下HNL在人体多个组织表达。此外，氧化胁迫、一些细胞因子(如IL-1β、TNF-α)能在体外诱导上皮细胞系表达HNL(Clin.J.Am.Soc.Nephrol.2010,5:2229-35；J.Immunol.2003,171:6630-9)。近年来，HNL作为肾损伤、肿瘤、急性细菌感染及炎症等疾病的早期诊断生物标志物越来越受到人们重视。HNL在早期诊断因抗肿瘤药物顺铂(Am.J.Nephrol.2004,24:307-15)、缺血(J.Am.Soc.Nephrol.2004,15:3073-82)、脓毒症(中国实用医药2015,24:46-47)、IgA肾病(Clin.Immunol.2007,123:227-34；中国中西医结合肾病杂志2013,3:223-226)、系统性红斑狼疮(Arthritis Rheum.2006,54:2577-84)、心脏外科手术(Lancet 2005,365:1231-8；Clin.Chim.Acta.2009,403:121-5；东南大学学报(医学版)2012,1:67-71)等引起的AKI时表现出了良好的早期预判能力。此外，有研究表明HNL具有作为卵巢癌(Int.J.Cancer 2007,120:2426-2434；实用肿瘤杂志2010,5:539-542.)、胰腺癌(Br.J.Cancer 2008,98:1540-1547.)、胃癌(Anat.Rec.2010,293:1855-1863.)、结肠直肠癌(Genet.Mol.Res.2014,13:7102-7112；肿瘤学杂志2009,2:115-119.)、乳癌(Biomed.Rep.2013,1:479-483；中国实用医药2011,20:43-45.)等癌症的生物标志物的潜力。Venge P.等人报道了HNL与急性感染的相关性(Scand.J.Clin.Lab Invest 2011,55:125-131；Clin.Chem.Lab Med.2011,49:999-1003；Int.Urol.Nephrol.2014, 46:2243-2249)。随着研究的不断深入，HNL作为疾病诊断生物标志物的功能越来越受到人们的重视。目前，HNL作为急性肾损伤早期诊断生物标志物的研究报道较多。与现行的临床上采用的血清肌酐(sCr)指标相比，许多研究结果显示HNL能提前1到2天预判患者是否将发生AKI，这为临床争取到了提前介入治疗AKI的宝贵时间，将来HNL有可能成为AKI临床即时就地检验(Point of Care Testing，POCT)项目。因此，急需开发便携、快速、易操作、定量的HNL检测技术。目前生物体液样本中HNL定量方法主要基于抗原抗体特异性反应的免疫检测技术，如RIA(国际专利WO/1995/029404A1和中国ZL 200980155194)、ELISA(欧洲专利EP 2225268和中国专利ZL200980155194)、Western-blotting、胶乳免疫比浊法(中国专利ZL 201410431182和ZL201210394943)、化学发光免疫分析法(中国专利申请号201510184818和201410197672)等。以上方法有各自的优点，但也存在缺点，尤其HNL作为POCT项目检测时它们的缺点尤为突出。如RIA存在测试时间过长、需要专门的防辐射场地、易造成环境污染等问题；ELISA自动化程度不高、实验操作时间长、需专业人员操作，且成本高。Western-blotting操作时间长而复杂，且测定精密度低；化学发光法测定线性范围较小，检测成本高；胶乳免疫比浊法特异性低、试剂稳定性和均一性差、检测线性范围窄及测试时间较长。可见上述HNL检测方法目前不能满足HNL的POCT项目检测要求。近年来，为了满足HNL快速定量的需求，多种免疫层析技术用于HNL的定量检测(中国专利ZL201220323587、ZL201420423962、ZL201220392399、ZL201220323586和ZL201220497401)等。免疫层析技术是一种快速诊断方法，常用于POCT项目。免疫层析基本原理是将特异的抗体或抗原预先固定在检测膜(如硝酸纤维素膜)的检测区内并进行干燥处理，当该干燥的膜的一端浸入样品后，由于毛细现象(毛细管作用)，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体或抗原的区域时，样品中相应的抗原或抗体即与该抗体或抗原发生特异性结合反应，经多种技术如荧光标记技术、免疫胶体金技术、免疫酶染色技术、量子点标记技术及上转换发光技术等方法使该检测区显示一定的信号，从而实现特异性定性或定量检测特定的抗原或抗体。因显色技术的不同免疫层析可分为免疫胶体金层析技术、免疫酶标层析技术、免疫荧光层析技术等。HNL免疫层析技术与上述其他HNL定量技术相比具有操作方便和检测快速等优点，但其缺点也很明显。荧光免疫层析由于荧光染料易发生衰退或淬灭影响产品稳定性；荧光乳胶颗粒的缺点是荧光染料系物理掺杂，容易发生泄漏，同时高分子乳胶颗粒的表面修饰方法有限且多数具有疏水性，从而易发生非特异性吸附。免疫胶体金技术采用物理吸附的方法结合，抗原或抗体易从金纳米颗粒表面脱落下来，导致标记物不稳定，从而影响检测性能。近年来，以上转换发光材料(up-converting phosphor，UCP)为显示剂的免疫层析上转换发光技术(up-converting phosphor technology，UPT)是目前该领域的一个研究开发热点。UCP由主基质(host matrix)、吸收子(absorber)和发射子(emitter)三部分组成，通常由稀土金属元素掺杂于晶体的晶格中构成。UCP具有上转发光现象，在红外光激发下发射可见光。由于无背景干扰、稳定性好、无焠灭、环境友好和生物相容性好等优异性能，UCP作为示踪剂已应用于多种POCT检测系统中。中国专利(ZL201220497401)公开了一种HNL检测的上转发光快速定量装置，该技术部分克服了目前HNL检测技术的不足本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同步联合定量检测不同分子形式人中性粒细胞脂质运载蛋白(HNL)的免疫层析装置，其特征在于：由样品稀释液冻干粉、标准品冻干粉及免疫层析试纸条组成；所述免疫层析试纸条由衬板、两层滤血膜、样品流动垫、UCP结合垫、分析膜和吸收垫组成；两层滤血膜分为前置滤血膜和后置滤血膜，两层滤血膜、样品流动垫、UCP结合垫、分析膜和吸收垫从前至后顺次搭接粘贴于衬板上，常规方法组装或用塑料壳进行封装；所述滤血膜经浓度为0.0～10μmol/L的fMLP溶液和7.0～28.5U/mL的肝素钠溶液浸泡湿润后晾干得到；所述UCP结合垫包被能同时识别单体、同二聚体和异二聚体三种分子形式人中性粒细胞脂质运载蛋白HNL的UCP标记的抗三种分子形式HNL抗体；所述分析膜上设有平行的三个检测区T1、T2、T3和一个质控区C，所述三个检测区依次包被抗基质金属蛋白酶‑9抗体、抗单体HNL抗体和抗同二聚体HNL抗体，所述抗体针对的抗原为人源HNL；质控区C包被抗UCP标记抗体来源动物免疫球蛋白的抗体；所述衬板用于支撑两层滤血膜、样品流动垫、UCP结合垫、分析膜和吸收垫的组装。

【技术特征摘要】
1.一种同步联合定量检测不同分子形式人中性粒细胞脂质运载蛋白(HNL)的免疫层析装置，其特征在于：由样品稀释液冻干粉、标准品冻干粉及免疫层析试纸条组成；所述免疫层析试纸条由衬板、两层滤血膜、样品流动垫、UCP结合垫、分析膜和吸收垫组成；两层滤血膜分为前置滤血膜和后置滤血膜，两层滤血膜、样品流动垫、UCP结合垫、分析膜和吸收垫从前至后顺次搭接粘贴于衬板上，常规方法组装或用塑料壳进行封装；所述滤血膜经浓度为0.0～10μmol/L的fMLP溶液和7.0～28.5U/mL的肝素钠溶液浸泡湿润后晾干得到；所述UCP结合垫包被能同时识别单体、同二聚体和异二聚体三种分子形式人中性粒细胞脂质运载蛋白HNL的UCP标记的抗三种分子形式HNL抗体；所述分析膜上设有平行的三个检测区T1、T2、T3和一个质控区C，所述三个检测区依次包被抗基质金属蛋白酶-9抗体、抗单体HNL抗体和抗同二聚体HNL抗体，所述抗体针对的抗原为人源HNL；质控区C包被抗UCP标记抗体来源动物免疫球蛋白的抗体；所述衬板用于支撑两层滤血膜、样品流动垫、UCP结合垫、分析膜和吸收垫的组装。2.如权利要求1所述的一种同步联合定量检测不同分子形式人中性粒细胞脂质运载蛋白(HNL)的免疫层析装置，其特征在于：所述的样品稀释液冻干粉是将20mL、pH＝7.2～7.5，含150～250mmol/L NaCl、0.25～0.5％(vol/vol)Tween-20、0.5％～2％(wt/vol)BSA的50～100mM HEPES缓冲液经机械或磁力搅拌充分后，采用0.22μm或0.45μm滤器进行过滤除菌后冻干获得。3.如权利要求1所述的一种同步联合定量检测不同分子形式人中性粒细胞脂质运载蛋白(HNL)的免疫层析装置，其特征在于：所述标准品冻干粉是400μg/mL的单体、同二聚体或异二聚体三种分子形式HNL的pH＝7.2～7.4、10mmol/L的PBS缓冲溶液10μL冻干获得。4.如权利要求1所述的一种同步联合定量检测不同分子形式人中性粒细胞脂质运载蛋白(HNL)的免疫层析装置，其特征在于：上转发光材料UCP为平均粒径为400～600nm的经二氧化硅包被和表面功能化修饰的由稀土金属元素所构成的晶体材料。5.如权利要求1所述的一种同步联合定量检测不同分子形式人中性粒细胞脂质运载蛋白(HNL)的免疫层析装置，其特征在于：首先将标准品冻干粉加入10μL去离子水充分溶解后制得标准品母液，然后用样品稀释液对标准品母液进行2倍法梯度稀释获得不同浓度的标准品梯度浓度溶液，取50～150μL标准品梯度浓度溶液加入水平放置的免疫层析装置的加样孔，加样孔为前置滤血膜或位于前置滤血膜上对应塑料壳预留缺口的位置；在15～20min内利用UPT读数仪对相应的T1、T2和T3带进行扫描读数，根据标准品峰面积读数绘制标准曲线；然后将待测的血清、血浆、尿样或全血样品经样品稀释液稀释5～200倍后，取50～150μL加入水平放置的免疫层析装置的加样孔；在15～20min内利用UPT读数仪对相应的T1、T2、和T3带进行扫描读数，然后根据绘制的标准曲线进行不同样本中不同分子形式NGAL的定量；样品稀释液冻干粉使用前加入20mL去离子水充分溶解后获得样品稀释液。6.权利要求1所述的一种同步联合定量检测不同分子形式人中性粒细胞脂质运载蛋白(HNL)的免疫层析装置的制备方法，其步骤如下：a)样品稀释液冻干粉的制备将20mL、pH＝7.2～7.5，含150～250mmol/L NaCl、0.25～0.5％(vol/vol)Tween-20、0.5％～2％(wt/vol)BSA的50～100mM HEPES缓冲液经机械或磁力搅拌充分后，样品稀释液采用0.22μm或0.45μm滤器进行过滤除菌，冻干后室温保存；b)标准品冻干粉的制备400μg/mL的单体、同二聚体或异二聚体三种分子形式HNL的pH＝7.2～7.4、10mmol/L的PBS缓冲溶液10μL冻干获得；c)滤血膜的制备滤血膜材料为玻璃纤维素膜或具有类似性质的膜材料，前置滤血膜和后置滤血膜上下两层相互错开搭接，经浓度为0.0～10μmol/L fMLP溶液和7.0～28.5U/mL肝素钠溶液浸泡；d)样品流动垫的制备样品流动垫材料为高亲水性的玻璃纤维或具有类似性质的膜材料，用于衔接滤血膜和UCP结合垫；e)UCP结...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡林君，杨津，陈雷，赵冰，姜春来，孔维，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22