一种感染细菌性败血症草鱼疾病模型的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种感染细菌性败血症草鱼疾病模型的构建方法，包括如下步骤：a)选取体重为45‑55g的草鱼，分为对照组及注射组，注射组草鱼注射1×107cfu/ml的嗜水气单胞菌，对照组注射等量生理盐水；b)两组草鱼分别饲养，分别于第0、1、3、7、14、21天取血液进行后续分析；c)进行如下检测：1)红细胞计数；2)白细胞计数；3)红细胞比容测定；4)平均红细胞容积测定；5)白细胞分类计数；6)总蛋白测定；7)溶菌酶测定；8)过氧化物酶测定；9)免疫球蛋白M测定；10)总补体测定。本发明专利技术为鱼类免疫学研究提供科研指导，并揭示养殖生产上鱼类发病程度及给药剂量，该疾病模型的构建为水产养殖业科学健康发展奠定了一定的基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及水产养殖
，具体地说，是一种感染细菌性败血症草鱼疾病模型的构建方法。
技术介绍
草鱼是草食性鱼类，也是我国优良的传统淡水渔业和淡水养殖的主要对象，草鱼养殖在我国已有1700多年的历史。2012年，我国草鱼产量为444多万吨，占我国淡水养殖鱼类总产量的20％(渔业统计年鉴，2012)，在世界淡水养殖鱼类中产量排名第一位。细菌性败血症也称为细菌性出血病、爆发性出血病，最早发现于20世纪70年代末至80年代初，是由致病性嗜水气单胞菌引起的急性转染病，从夏花鱼种到成鱼均可感染，严重地阻碍了草鱼养殖业的发展。鱼类试验动物疾病模型在新渔药研发过程中起着举足轻重的作用，新渔药研发流程有以下四个阶段：第一个阶段是专利技术(发现)阶段，第二个阶段是非临床(临床前)研究阶段，第三个阶段是临床研究阶段，第四个阶段是上市后阶段。鱼类试验动物疾病模型一般在第三阶段发挥作用，此阶段主要确定新渔药产品是否有进一步研发的意义。该试验包括试验动物疾病模型耐受性试验，寻找有效剂量和中毒剂量范围，确定试验动物的有效性和安全性；开展试验动物疾病模型的药代动力学及生物利用度试验，为下步推荐临床使用剂量提供依据，即用健康靶动物在可控条件下进行药效对照试验，并进行鱼类试验动物疾病模型药代动力学试验，确定初步的有效剂量，因此也有人称为剂量确定实验。试验动物疾病模型对于学科和技术的发展极为重要，医学和陆生动植物已建立了包括动物试验、组织培养和病原保藏中心等在内的数百种标准试验模型，有力地促进了医学和陆生动植物病害研究的发展，而水生生物标准的试验模型(包括组织培养模型、鱼类试验动物疾病模型和病原库)相对来说数量极少。中国专利201210115340X，公开了一种草鱼水霉病疾病的建立方法，所述的方法选自下列方法中的一种：1)将草鱼刮伤后置于含水霉孢子1×103-1×105个/mL的水体中，25℃下恒温养殖；2)将草鱼刮伤后置于含水霉孢子1×103-1×105个/mL的水体中，使水温在1h内降低8～12℃或者使水温在1h内升高8～12℃，养殖。中国专利201110001159.1，公开了一种建立鱼类脂肪肝
实验模型的建立方法，包括以下步骤：1)采用腹腔注射的方式，对草鱼一次性注射硫代乙酰胺的生理盐水溶液，注射完毕后进行养殖；所述硫代乙酰胺的生理盐水溶液中硫代乙酰胺的浓度为100～200mg/ml；2)养殖过程中，投喂油脂总量为4～6％的配合饲料，养殖2～6周。而关于本专利技术的感染细菌性败血症草鱼疾病模型，目前还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种感染细菌性败血症草鱼疾病模型的构建方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：一种感染细菌性败血症草鱼疾病模型的构建方法，所述方法包括如下步骤：a)选取体重为45-55g的草鱼，平均分为对照组及注射组，注射组草鱼注射浓度为1×107cfu/ml的嗜水气单胞菌，对照组注射等量生理盐水；b)两组草鱼分别饲养，分别于第0、1、3、7、14、21天取血液进行后续分析；c)观察指标，取两组草鱼血液进行如下检测：1)红细胞计数(RBC)；2)白细胞计数(WBC)；3)红细胞比容测定(HCT)；4)平均红细胞容积测定(MCV)；5)白细胞分类计数；6)总蛋白测定(TP)；7)溶菌酶测定(LSY)；8)过氧化物酶测定(POD)；9)免疫球蛋白M测定(IgM)；10)总补体测定(ACH50)。所述检测的方法如下：1)红细胞计数(RBC)，取新鲜血液20ul，加入到4mlNatt-Herricks缓冲液中，轻摇混匀后静置2-3分钟，之后取10ul血液稀释液充入细胞计数板中，显微镜放大20倍计数，记数区位于细胞计数板中央大方格的四角及中间的五个中方格；2)白细胞计数(WBC)，步骤同红细胞计数，白细胞记数区位于细胞计数板
四角四个大方格内；3)红细胞比容测定(HCT)，将新鲜血液充入温氏管中，离心机10000×g，5分钟，离心后静置10-20分钟，记下温氏管读数，乘以0.1即为红细胞比容值；4)平均红细胞容积测定(MCV)，采用如下公式换算： M C V = H C T × 10 15 R B C × 10 12 f l ]]>5)白细胞分类计数，用胶头滴管滴一滴新鲜血液于载玻片上，用另一片载玻片将其推平，等血膜风干，之后用瑞氏染液染色，水洗风干后，放置在100倍显微镜下计数；计数原则是随机视野下共计数100个白细胞，分别算出嗜中性粒细胞，单核细胞，血栓细胞及淋巴细胞百分比；6)总蛋白测定(TP)，采用考马斯亮蓝法，考马斯亮蓝G-250试剂配方如下表，7)溶菌酶测定(LSY)，溶菌酶的测定使用鱼类血清溶菌酶测定试剂盒测定；8)过氧化物酶测定(POD)，过氧化物酶的测定使用鱼类血清过氧化物酶测定试剂盒测定；9)免疫球蛋白M测定(IgM)，免疫球蛋白M的测定采用鱼类血清免疫球蛋白M测定试剂盒测定；10)总补体测定(ACH50)，总补体的测定使用鱼类血清总补体测定试剂盒测定。优选地，所述观察指标如下：1)注射后第7、14、21天白细胞计数；2)注射后第1、7天单核细胞百分比；3)注射后第1天嗜中性粒细胞百分比；4)注射后第14天血栓细胞百分比；5)注射后第14天淋巴细胞百分比；6)注射后第1、3天血清总蛋白含量；7)注射后第3天血清溶菌酶活力；8)注射后第1天血清过氧化物酶活力；9)注射后第7天免疫球蛋白M水平。本专利技术优点在于：本专利技术的感染细菌性败血症草鱼疾病模型为患有细菌性败血症草鱼提供参考；在不同的免疫时间，草鱼体内免疫应答强弱也不同，养殖生产上的给药剂量可以根据本专利技术的模型作出相应调整。在整个草鱼及鱼类养殖业上，该疾病模型不仅可以为鱼类免疫学研究提供科研指导，并且可以揭示养殖生产上鱼类发病程度及给药剂量，该疾病模型的构建为水产养殖业科学，健康的发展奠定了一定的基础。附图说明附图1为建模后两组草鱼分别在第0、1、3、7、14、21天存活率统计。附图2为血液学指标测定结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种感染细菌性败血症草鱼疾病模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：a)选取体重为45‑55g的草鱼，平均分为对照组及注射组，注射组草鱼注射浓度为1×107cfu/ml的嗜水气单胞菌，对照组注射等量生理盐水；b)两组草鱼分别饲养，分别于第0、1、3、7、14、21天取血液进行后续分析；c)观察指标，取两组草鱼血液进行如下检测：1)红细胞计数(RBC)；2)白细胞计数(WBC)；3)红细胞比容测定(HCT)；4)平均红细胞容积测定(MCV)；5)白细胞分类计数；6)总蛋白测定(TP)；7)溶菌酶测定(LSY)；8)过氧化物酶测定(POD)；9)免疫球蛋白M测定(IgM)；10)总补体测定(ACH50)。

【技术特征摘要】
1.一种感染细菌性败血症草鱼疾病模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：a)选取体重为45-55g的草鱼，平均分为对照组及注射组，注射组草鱼注射浓度为1×107cfu/ml的嗜水气单胞菌，对照组注射等量生理盐水；b)两组草鱼分别饲养，分别于第0、1、3、7、14、21天取血液进行后续分析；c)观察指标，取两组草鱼血液进行如下检测：1)红细胞计数(RBC)；2)白细胞计数(WBC)；3)红细胞比容测定(HCT)；4)平均红细胞容积测定(MCV)；5)白细胞分类计数；6)总蛋白测定(TP)；7)溶菌酶测定(LSY)；8)过氧化物酶测定(POD)；9)免疫球蛋白M测定(IgM)；10)总补体测定(ACH50)。2.根据权利要求1所述感染细菌性败血症草鱼疾病模型的构建方法，其特征在于：所述检测的方法如下：1)红细胞计数(RBC)，取新鲜血液20ul，加入到4mlNatt-Herricks缓冲液中，轻摇混匀后静置2-3分钟，之后取10ul血液稀释液充入细胞计数板中，显微镜放大20倍计数，记数区位于细胞计数板中央大方格的四角及中间的五个中方格；2)白细胞计数(WBC)，步骤同红细胞计数，白细胞记数区位于细胞计数板四角四个大方格内；3)红细胞比容测定(HCT)，将新鲜血液充入温氏管中，离心机10000×g，5分钟，离心后静置10-20分钟，记下温氏管读数，乘以0.1即为红细胞比容值；4)平均红细胞容积测定(MCV)，采用如下公式换算： M C V = H C T × 10 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：李家乐，李立森，黄文吉，党云飞，徐晓雁，沈玉帮，方圆，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海;31