一种黄缘盒龟唾液及口腔上皮中提取DNA的方法技术

本发明专利技术涉及一种黄缘盒龟唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，属于DNA分离纯化技术领域。用口拭子插入黄缘盒龟的口腔，在口腔上下部来回擦拭后放入装有PBS溶液中，震荡；加入裂解液，混匀后水浴；离心，沉淀加碘化钾溶液，漩涡，再分别加入NaCl和酚/氯仿溶液，震荡，离心；取上清液，加入与上清同样体积的异丙醇，涡旋震荡离心；弃上清液，在沉淀中加入70%乙醇洗涤，离心；沉淀室温晾干，当沉淀块变透明时，加入TE缓冲液溶解。将发明专利技术应用于黄缘盒龟DNA提取，具有操作便捷、黄缘盒龟损伤小等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种黄缘盒龟唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，属于DNA分离纯化

技术介绍
黄缘盒龟(Cistoclemmys flavomarginata,Yellow-margined Box Turtle)隶属于龟鳖目(Testudinata)、淡水龟科(Geoemydidae)、盒龟属(Cistoclemmys)。因其背甲缘盾腹部黄色，眼眶上有一条金黄色条纹，故得名。黄缘盒龟在我国主要分布于浙江、安徽、福建、江苏、河南、广西、广东、台湾等地，邻国日本也有分布。我省主要分布在临安、建德、安吉、龙游、天台、新昌等地。由于黄缘盒龟为龟中珍品，是高级的滋补品，其药用价值较高，还具有较大的观赏价值。近年来，由于人为过渡捕捉，野生黄缘盒龟资源及其栖息地受到严重破坏，野生数量急剧减少。1998年该种群已被列入国家珍稀濒危动物，2006年被联合国列为濒危级动物种群(IUCN，2006)。除人为因素以外，由于野生黄缘盒龟生长缓慢，加之，全球气候变暖以及恶劣反常天气的频繁出现，使其交配环境、孵化条件等与最适条件有了不小的差距，所以性成熟后产卵量极少，受精率、孵化率及成活率均极低，并且对其性别分化等也产生了较大影响，导致野生种群濒临灭绝。目前，对我省野生黄缘盒龟的种质资源调查，以及与临近省份野生种群亲缘关系分析鉴定尚未有效开展，对黄缘盒龟拟生态驯养繁殖开展尚处于探索阶段。我省已有几家养殖企业开始试探性养殖黄缘盒龟，但由于黄缘盒龟生长周期长，纯系和杂交龟在稚龟期差异较小，养殖6-8年后珍品黄缘盒龟性状才能显现，从而产生了较大的养殖风险。传统用于DNA提取的样本主要来源于血液或组织块，但是对于野生濒危动物，取血和获取组织块都对动物本身具有伤害并有可能带来疾病感染，对其生存具有一定的隐患。基于此，做出本申请。
技术实现思路
为了克服现有黄缘盒龟鉴定所存在的上述缺陷，本申请提供一种简便易行、采集方便、无创伤的黄缘盒龟唾液及口腔上皮中提取DNA的方法。为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：一种黄缘盒龟唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，包括如下步骤：(1)用口拭子插入黄缘盒龟的口腔，在口腔上下部来回擦拭后放入装有500μL的0.01mol/L PBS溶液中，用涡旋振荡器震荡2min，取出口拭子；(2)加入1mL二硫苏糖醇(DTT)裂解液，混匀后水浴；(3)离心，沉淀加碘化钾溶液，漩涡，再分别加入NaCl和酚/氯仿溶液，震荡，离心；(4)取上清液，加入与上清同样体积的异丙醇，涡旋震荡离心；(5)弃上清液，吸去沉淀中的多余液体，在沉淀中加入70％乙醇洗涤2次，离心；(6)沉淀室温晾干，当沉淀块变透明时，加入TE缓冲液溶解。进一步的，作为优选：步骤(2)中，裂解液构成为：100mmol/L Tris-HCl，pH8，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，0.4mol/L DTT。步骤(2)中，水浴温度为40～60℃，水浴时间1-4小时。步骤(3)中，碘化钾溶液的浓度为3-5mol/L。步骤(3)中，NaCl溶液质量浓度为0.5-1.5％；酚/氯仿溶液中，酚：氯仿＝25∶24(体积比)；NaCl与酚/氯仿溶液添加体积比为1:1-2。通过本申请技术方案的实施，通过收集评价野生黄缘盒龟种质资源，采用“唾液”取样方式，这种方式可在不伤害甚至不必见到动物的情况下，利用这些样品提取动物DNA并进行PCR扩增，再利用mtDNA，PCR等遗传学、分子生物学技术，建立黄缘盒龟种质分子鉴定分析方法，实现在不影响野生种群分布的前提下探明黄缘盒龟野生资源现状，所建立的黄缘盒龟种质分子鉴定方法，有利于探明野生黄缘盒龟种质资源，并通过对野生黄缘盒龟的生活、交配、繁育等条件调查，构建黄缘盒龟拟生态驯养繁殖体系，从而进行生物个体遗传信息的分析；最终有效的保护这一濒危物种，为保护物种多样性，也为中医药自然资源的可持续利用提供途径。附图说明图1为本申请的琼脂糖核酸电泳检测谱图。具体实施方式实施例1取0.1mL黄缘盒龟唾液置于1.5mL离心管中，加0.01mol/L PBS溶液500
μL，反复吹打几下，加入裂解液(100mmol/L Tris-HCl，pH＝8，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，0.4mol/L DTT)，混匀后40℃水浴4小时；12000g离心5min；沉淀加50μL 3mol/L的碘化钾溶液，漩涡30s，再加100μL 0.5％NaCl和100μL酚/氯仿溶液(酚∶氯仿＝25∶24)，震荡30s，12000g离心5min；取上清，加入与上清等体积的异丙醇，混匀，12000g离心5min；沉淀加入500μL无水乙醇洗涤，12000g离心5min。沉淀室温晾干，用TE缓冲液溶解。实施例2取0.1mL黄缘盒龟唾液置于1.5mL离心管中，加0.01mol/L PBS溶液500μL，反复吹打几下，加入裂解液(100mmol/L Tris-HCl，pH＝8，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，0.4mol/L DTT)，混匀后45℃水浴3小时；12000g离心5min；沉淀加50μL 4mol/L的碘化钾溶液，漩涡30s，再加100μL 1.2％NaCl和120μL酚/氯仿溶液(酚∶氯仿＝25∶24)，震荡30s，12000g离心5min；取上清，加入与上清等体积的异丙醇，混匀，12000g离心5min；沉淀加入500μL无水乙醇洗涤，12000g离心5min。沉淀室温晾干，用TE缓冲液溶解。实施例3取0.1mL黄缘盒龟唾液置于1.5mL离心管中，加0.01mol/L PBS溶液500μL，反复吹打几下，加入裂解液(100mmol/L Tris-HCl，pH＝8，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，0.4mol/L DTT)，混匀后55℃水浴2小时；12000g离心5min；沉淀加50μL 5mol/L的碘化钾溶液，漩涡30s，再加100μL 0.9％NaCl和150μL酚/氯仿溶液(酚∶氯仿＝25∶24)，震荡30s，12000g离心5min；取上清，加入与上清等体积的异丙醇，混匀，12000g离心5min；沉淀加入500μL无水乙醇洗涤，12000g离心5min。沉淀室温晾干，用TE缓冲液溶解。实施例4取0.1mL黄缘盒龟唾液置于1.5mL离心管中，加0.01mol/L PBS溶液500μL，反复吹打几下，加入裂解液(100mmol/L Tris-HCl，pH＝8，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，0.4mol/L DTT)，混匀后60℃水浴1小时；12000g离心5min；沉淀加50μL 5mol/L的碘化钾溶液，漩涡30s，再加100μL 1.5％NaCl和200μL酚/氯仿溶液(酚∶氯仿＝25∶24)，震荡30s，12000g离心5min；取上清，加入与上清等体积的异丙醇，混匀，12000g离心5min；沉淀加入500μL无水乙醇
洗涤，12000g离心5min。沉淀室温晾干，用TE缓冲液溶解。将上述实施例的溶解液进行如下处理：(a)PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄缘盒龟唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）用口拭子插入黄缘盒龟的口腔，在口腔上下部来回擦拭后放入装有500 μL的0.01 mol /LPBS 溶液中，用涡旋振荡器震荡2min，取出口拭子；（2）加入1mL裂解液，混匀后水浴；（3）离心，沉淀加碘化钾溶液，漩涡，再分别加入NaCl和酚/氯仿溶液，震荡，离心；（4）取上清液，加入与上清同样体积的异丙醇，涡旋震荡离心；（5）弃上清液，在沉淀中加入70%乙醇洗涤2次，离心；（6）沉淀室温晾干，当沉淀块变透明时，加入TE 缓冲液溶解。

【技术特征摘要】
1.一种黄缘盒龟唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）用口拭子插入黄缘盒龟的口腔，在口腔上下部来回擦拭后放入装有500 μL的0.01 mol /LPBS 溶液中，用涡旋振荡器震荡2min，取出口拭子；（2）加入1mL裂解液，混匀后水浴；（3）离心，沉淀加碘化钾溶液，漩涡，再分别加入NaCl和酚/氯仿溶液，震荡，离心；（4）取上清液，加入与上清同样体积的异丙醇，涡旋震荡离心；（5）弃上清液，在沉淀中加入70%乙醇洗涤2次，离心；（6）沉淀室温晾干，当沉淀块变透明时，加入TE 缓冲液溶解。2.如权利要求1所述的一种黄缘盒龟唾液及口腔上皮中提取DNA的方法，其特征在于：步骤（2）中，裂解液构成为：10...

【专利技术属性】
技术研发人员：寿建昕，
申请(专利权)人：绍兴文理学院元培学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33