CRISPR-Cas9引导序列及其引物、转基因表达载体及其构建方法技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体涉及一种CRISPR‑Cas9引导序列引物、转基因表达载体及其构建方法。该CRISPR‑Cas9引导序列sgRNA包括针对SIDT1基因的靶点位于E1外显子上的Target site‑1和针对SIDT1基因的靶点位于E2外显子上的Target site‑2；其中，Target site‑1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，Target site‑2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。该CRISPR‑Cas9转基因表达载体，所述表达载体包括在重组穿梭cas9工具质粒的BsmB I和Bbs I酶切位点连接有cas9引导序列Target site‑1和Target site‑2。本发明专利技术所述的重组穿梭cas9工具质粒能够快速的装配上针对基因组两个靶位点的引导序列进而包装成针对两个靶位点重组腺病毒载体，并且可单独完成对大片段基因组的编辑，不依赖于协同作用；且构建过程简单快捷，发挥基因组大片段编辑作用的效率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种CRISPR-Cas9引导序列引物、转基因表达载体(尤其是一种基于复制缺陷型腺病毒的双启动子CRISPR-Cas9转基因载体)及其构建方法。
技术介绍
基因组编辑可以通过DNA片段删除、染色体倒位、DNA片段插入等方式来实现，是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人类遗传性疾病治疗、病毒整合相关疾病的治疗以及动物模型的制作，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点。早期仅基于同源重组的基因打靶技术效率极低，应用受到限制。随着人工核酸内切酶(engineered endonuclease，EEN)出现，将这一现状彻底改变。第一代人工核酸内切酶是锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)。锌指蛋白是一类能够结合DNA的蛋白质，人类细胞的转录因子中大约有一半含有锌指结构，ZFN是将锌指蛋白与核酸内切酶FokⅠ融合形成的核酸内切酶[Kim Y G,Cha J,Chandrasegaran S.Hybrid restriction enzymes:zinc finger fusions to FokⅠcleavage domain.Proc Natl Acad SciUSA,1996,93(3):1156-1160]，利用它可以在各种复杂基因组的特定位置制造DNA的双链切口。到目前为止，ZFN已经成功应用于黑长尾猴、大鼠、小鼠、中国仓鼠、斑马鱼、果蝇、海胆、家蚕、拟南芥、烟草、玉米、猪、牛、人类iPS细胞[Urnov F D,Rebar E J,Holmes M C,et al.Genome editing with engineered zinc finger nucleases.Nat Rev Genet,2010,11(9):636-646]。更令人振奋的是已经有用于治疗HIV的ZFN(破坏人CCR基因表达)药物进入二期临床试验[Perez E E,Wang J,Miller J C,et al.Establishment of HIV-1resistance in CD4+T cells by genome editing using zinc-finger nucleases.Nat Biotechnol,2008,26(7):808-816]。但是，ZFN制备复杂，成本昂贵，而且其技术专利被少数几家商业公司控制，因此其应用受到限制。很快，第二代人工核酸酶———类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)的出现在很大程度上替代了ZFN。2009年，科学家将一种水稻的致病菌(Xanthamonas)编码的类转录激活因子效应物(transcription activator-likeeffector，TALE)与DNA的碱基对应关系解密[Moscou M J,Bogdanove A J.A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.Science,2009,326(5959):1501]。2010年，首次报道TALEN蛋白在酵母中应用成功[Li T,Huang S,Zhao X,et al.Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes.Nucleic acids Res,2011,39(14):6315-6325]，之后，在植物、人类细胞、小鼠、斑马鱼、猪、牛中得到迅速的应用[Joung J K,Sander J D.TALENs:a widely applicable technology for targeted genome editing.Nat Rev Mol Cell Biol,2013,14(1):49-55]。TALEN相对于ZFN其构建较为简单，特异性更高，因此受到了科研工作者的青睐。但是ZFN和TALEN对靶点的识别主要依赖于DNA结合蛋白对核酸的识别.ZFN中一个锌指蛋白(结构单元)识别三个碱基序列，而TALEN的一个RVD识别一个碱基，为了保证特异性，通常靶点长度在18-20bp.因此，在构建ZFN或是TALEN时需要根据靶点的序列来将锌指蛋白单元或是RVD排列组合起来，需拼接的片段多、操作繁琐、制备周期长、需要耗费大量的劳动和费用。并且耗费大量的劳动和费用完成的载体仅仅能针对一个识别位点进行基因编辑，如果要实现大片段的基因编辑，就必需要同时构建针对两个位点的载体，后续还需要将这些载体共同转入目的样本且依赖于协同作用才能完成特定位点的基因编辑，难度大、费用高、效率低、周期长。来源于细菌的CRISPR-Cas9系统在真核细胞内也能很好的工作，这显示出了其巨大的应用潜
力。例如在基础研究领域，CRISPR-Cas9系统可以快捷的用来构建基因定点突变、删除或者敲入的细胞系或者动物模型，从而有利于各物种基因的生物学功能研究。CRISPR-Cas9系统在商业领域的应用潜力也同样巨大。例如在生物治疗领域，结合诱导多能干细胞(iPS)技术，人们可以将通过基因编辑修复的iPS细胞重新发育为正常组织和器官来供病人使用。在畜牧业育种工作中，对一些影响性状基因进行编辑能够大大加快良种的育种速度。甚至可以利用病毒载体递送系统，用于艾滋病和宫颈癌等疾病的治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种CRISPR-Cas9引导序列及其引物、转基因表达载体及其构建方法。本专利技术的目的通过以下技术方案来实现：本专利技术的第一目的在于提供一种CRISPR-Cas9引导序列sgRNA，所述sgRNA包括针对SIDT1基因(SID1transmembrane family member 1，Gene ID:54847，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/54847)的靶点位于E1外显子上的Target site-1和针对SIDT1基因的靶点位于E2外显子上的Target site-2；其中，Target site-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，Target site-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。本专利技术的第二目的在于提供一种针对上述CRISPR-Cas9引导序列sgRNA的引物，包括：针对SIDT1基因的靶点位于E1外显子上的Target site-1(SEQ ID NO.8)的引物对：Target site-1-F：SEQ ID NO.18；Target site-1-R：SEQ ID NO.19；以及针对SIDT1基因的靶点位于E2外显子上的Target site-2(SEQ ID NO.9)的引物对：Target site-2-F：SEQ ID NO.20；Target site-2-R：SEQ ID NO.21。本专利技术的第三目的在于提供一种CRISPR-Cas9转基因表达载体，所述表达载体包括在重组穿梭本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CRISPR‑Cas9引导序列sgRNA，所述sgRNA包括针对SIDT1基因的靶点位于E1外显子上的Target site‑1和针对SIDT1基因的靶点位于E2外显子上的Target site‑2；其中，Target site‑1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，Target site‑2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR-Cas9引导序列sgRNA，所述sgRNA包括针对SIDT1基因的靶点位于E1外显子上的Target site-1和针对SIDT1基因的靶点位于E2外显子上的Target site-2；其中，Target site-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，Target site-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。2.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas9引导序列sgRNA的引物，包括：针对SIDT1基因的靶点位于E1外显子上的Target site-1的引物对：Target site-1-F：如SEQ ID NO.18所示；Target site-1-R：如SEQ ID NO.19所示；以及针对SIDT1基因的靶点位于E2外显子上的Target site-2的引物对：Target site-2-F：如SEQ ID NO.20所示；Target site-2-R：如SEQ ID NO.21所示。3.一种CRISPR-Cas9转基因表达载体，所述表达载体包括在重组穿梭cas9工具质粒的BsmB I和Bbs I酶切位点连接有cas9引导序列Target site-1和Target site-2。4.根据权利要求3所述的一种CRISPR-Cas9转基因表达载体，其特征在于：所述重组穿梭cas9工具质粒包括N端带有3flag标签、核定位信号NLS1、C端带有核定位信号NLS2的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)cas9基因编码序列，如SEQ ID NO.5所示的CMV启动子、如SEQ ID NO.6所示的人hU6启动子和如SEQ ID NO.7所示的人H1启动子；其中，3flag标签的序列如SEQ ID NO.2所示；核定位信号NLS1的序列如SEQ ID NO.3所示；核定位信号NLS2的序列如SEQ ID NO.4所示；肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)cas9基因编码序列如SEQ ID NO.1所示。5.根据权利要求3或4所述的一种CRISPR-Cas9转基因表达载体，其特征在于：包含cas9编辑基因及靶向序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：祁伟，俞磊，林高武，
申请(专利权)人：世翱上海生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31