一种促进微生物产漆酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种促进微生物产漆酶的方法，属于微生物发酵领域。本发明专利技术方法包括在阿魏蘑等高等真菌液态发酵过程中，添加β‑胡萝卜素及其它部分类胡萝卜素物质或者产β‑胡萝卜素微生物以及含有β‑胡萝卜素及其它部分类胡萝卜素物质的提取物来提高漆酶的活性，提高幅度最高可达不添加的12倍。此方法简单、可提高漆酶活性的幅度较大，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种促进微生物产漆酶的方法，属于微生物发酵领域。
技术介绍
漆酶(苯二酚：氧氧化还原酶，EC 1.10.3.2)是一类在自然界中广泛分布的含铜多酚氧化酶，能直接催化酚类、芳胺类等多种有机底物发生氧化反应。漆酶能对多种底物进行单电子氧化，这使其在制浆造纸、废水处理、有机合成等多个工业领域有诱人的应用前景。在自然界中丝状真菌，特别是担子菌和子囊菌是主要的漆酶合成菌，但是担子菌和子囊菌较低的漆酶产量不能满足日益增长的工业需求。担子菌和子囊菌发酵法合成漆酶的水平除了与菌种、营养物质、培养条件有关外，还受一些促进因子的影响，其中铜离子是漆酶活性中心的组成成分，也是漆酶合成的一种有效促进因子。同时，某些小分子芳香族化合物由于结构与木质素结构单元类似，也可以作为漆酶合成的促进因子，在研究中被广泛用于提高漆酶产量，如愈创木酚、藜芦醇、香兰素和肉桂酸等。但是当前已发现的有效的促进因子，通常价格昂贵，这在一定程度上提高了漆酶生产成本，而且添加铜离子和芳香化合物会污染环境，发酵结束后，发酵液需要脱毒处理，不利于漆酶产业化的应用。因此，寻找与发现经济、安全、高效的新型促进因子，是促进漆酶生产的一个重要方向，也将为微生物发酵产漆酶的实际应用和工业化生产注入新的可能与活力。
技术实现思路
本专利技术的目的首先是提供一种微生物产漆酶的促进剂。所述促进剂的有效成分是类胡萝卜素。包括类胡萝卜素中的一种或者几种的混合。所述微生物主要包括产漆酶的丝状真菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述促进剂的有效成分是β-胡萝卜素和/或番茄红素。在本专利技术的一种实施方式中，所述丝状真菌包括但不限于阿魏蘑、变色栓菌、粗皮侧耳、灵芝。在本专利技术的一种实施方式中，所述促进剂可以是类胡萝卜素、产类胡萝卜素的微生物或者含有类胡萝卜素的提取物。本专利技术还提供一种促进微生物产漆酶的方法，是在微生物产漆酶的过程中添加所述微生物产漆酶的促进剂。在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物主要包括产漆酶的丝状真菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述丝状真菌包括但不限于阿魏蘑(Pleurotus ferulae)、变色栓菌(Trametes versicolor)、粗皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、灵芝(Ganoderma Lucidum)。在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物产漆酶的促进剂的添加形式可以是类胡萝卜素化合物或者含有类胡萝卜素的混合物；添加量和添加时间可以根据微生物产漆酶的情况进行调整或者选择。所述含有类胡萝卜素的混合物可以是产类胡萝卜素的活性微生物或者灭活菌体，或者含有类胡萝卜素的提取物等。所述产类胡萝卜素的活性微生物包括但不限于胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)、锁掷酵母(Sporidiobolus pararoseus)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)。在本专利技术的一种实施方式中，所涉及的菌种均为本领域常见菌种；菌种培养方法均可为本领域常用培养方法。在本专利技术的一种实施方式中，类胡萝卜素的添加量为0.1-30mg/L，添加方法为称取定量类胡萝卜素溶于丙酮中，溶液过有机滤膜除菌，得到的无菌溶液通过减压旋转蒸发仪上蒸干，再将上述物质溶于已灭菌的植物油中，分别将油溶物添加微生物产漆酶的发酵培养基中。所述含有类胡萝卜素的混合物可以是产类胡萝卜素的活性微生物或者灭活菌体，或者含有类胡萝卜素的提取物。在本专利技术的一种实施方式中，添加产类胡萝卜素的活性微生物是培养产类胡萝卜素的微生物，在产漆酶的微生物的发酵过程中，添加适量微生物菌体，共培养一段时间。在本专利技术的一种实施方式中，添加产类胡萝卜素的灭活菌体是将培养好的产类胡萝卜素的微生物在70℃下水浴1h，在产漆酶的微生物的发酵过程中，添加适量灭活菌体，继续培养一段时间。在本专利技术的一种实施方式中，添加含有类胡萝卜素的提取物是收集菌体，反复冻融使菌体破碎，然后70℃热处理1h，离心后去上清，然后在沉淀中加入一定体积的植物油，轻微振荡提取1h，即获得油提物，在上述操作过程中，保证油提物无菌；将油提物添加至发酵体系中并继续发酵一段时间。本专利技术的优点：1、添加形式具有多样性。即可直接添类胡萝卜素，也可添加含有类胡萝卜素的提取物或者添加产类胡萝卜素的微生物，也可添加经过处理的产类胡萝卜素的微生物。2、作用范围广泛。添加的物质对多种微生物产漆酶的均具有促进作用。3、促进作用显著。本专利技术发现添加类胡萝卜素或者产类胡萝卜素的酵母都可使阿魏蘑所
产漆酶的活性提高2倍以上，对其他高等真菌所产漆酶的活性提高幅度可达12倍。具体实施方式漆酶活性的测定方法：以ABTS为底物，在1mL反应体系中，含有880μL 0.1mol·L-1乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.5)，100μL终浓度1mmol·L-1的ABTS底物和20μL稀释一定倍数的粗酶液(须使最终的吸光值在0.2-0.8之间)，在30℃下反应5min后在420nm下测定其吸光值(以热灭活的酶液为空白对照)。漆酶的酶活力定义：在上述反应条件和反应体系下，每分钟氧化1μmol ABTS底物所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U)。酶活力按以下公式计算：A1—空白对照的吸光值；A2—反应后的吸光值；t—反应的时间；ε—ABTS的摩尔吸光系数，为3.6×104L·mol-1·cm-1。β-胡萝卜素的测定方法：(1)标准溶液的配置：精确称取2mg的β-胡萝卜素或番茄红素标准品，用氯仿定容至10mL的棕色容量瓶中，-20摄氏度避光保存备用。(2)样品的制备：a发酵液中β-胡萝卜素或番茄红素含量测定：取80ml发酵液，加80ml氯仿振荡提取15分钟，分离后将氯仿溶液置于减压旋转蒸发仪上浓缩至10ml，制备成含β-胡萝卜素或番茄红素的氯仿提取液；b胶红酵母中β-胡萝卜素含量测定：将胶红酵母菌体冷冻干燥后，称取1g菌体于研钵中充分研磨破碎，转移至5mL EP管中，加入2mL的氯仿振荡提取15min，离心后取上清氯仿定容至10mL，制成含β-胡萝卜素的氯仿提取液，；c共培养体系中β-胡萝卜素含量测定：取150ml发酵液，离心后去上清，菌体沉淀经充分研磨破碎后加80ml氯仿振荡提取15分钟，分离后将氯仿溶液置于减压旋转蒸发仪上浓缩至10ml，制备成含β-胡萝卜素的氯仿提取液。(3)进行LC-MS检测。色谱条件：采用WatersAcquity UPLC BEH C18柱(2.1mm x 100mm)分离，WatersAcquity PDA检测。流动相:A相:10/90的乙腈/异丙醇；B相:乙腈。柱温45℃，流速0.3mL·mL-1，进样量2μL。质谱条件：所用仪器WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS；离子化方式:ESI+；毛细管电压:3.5kV,锥孔电压:30V；脱溶剂气温度:400℃；脱溶剂
气流速700L·Hr-1；碰撞能量：6eV；质量范围:100-1500；检测电压1800V。(4)β-胡萝卜素含量按以下公式计算：m:10ml样品中β-胡萝卜素或番茄红素含量(mg)m1:标样进样体积中β-胡萝卜素含量或番茄红素(mg)m2:样品称样质量(mg)A1:标样峰面本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微生物产漆酶的促进剂，其特征在于，有效成分是类胡萝卜素，包括类胡萝卜素中的一种或者几种的混合。

【技术特征摘要】
1.一种微生物产漆酶的促进剂，其特征在于，有效成分是类胡萝卜素，包括类胡萝卜素中的一种或者几种的混合。2.根据权利要求1所述的一种微生物产漆酶的促进剂，其特征在于，所述微生物主要包括产漆酶的丝状真菌，包括但不限于阿魏蘑、变色栓菌、粗皮侧耳、灵芝。3.根据权利要求1所述的一种微生物产漆酶的促进剂，其特征在于，有效成分是β-胡萝卜素和/或番茄红素。4.根据权利要求1-3任一所述的一种微生物产漆酶的促进剂，其特征在于，所述促进剂是类胡萝卜素，或者含有类胡萝卜素的混合物，或者产类胡萝卜素的微生物，或者含有类胡萝卜素的提取物。5.一种促进微生物产漆酶的方法，其特征在于，是在微生物产漆酶的过程中添加权利要求1所述微生物产漆酶的促进剂。6.根据权利要求5所述的一种促进微生物产漆酶的方法，其特征在于，所述微生物主要包括产漆酶的丝状真菌；所述丝状真菌包括但不限于阿魏蘑(Pleurotus ferulae)、变色栓菌(Trametes versicolor)、粗皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、灵芝(Ganode...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁重阳，郭超林，赵丽婷，鲁冰心，王琼，彭林，陆健，顾正华，石贵阳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32