一种利用粗皮韧革菌同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用粗皮韧革菌同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，涉及生物工程技术领域。所述制备方法依次经过试管扩大培养、液体摇瓶培养和种子罐扩大培养、固体前发酵培养、液体后发酵培养及提取分离步骤制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体；再分别经过提取制得银杏内酯B和槲皮素晶体。本发明专利技术以去皮白果和大米为固体基质添加银杏叶提取物，以粗皮韧革菌为菌种通过固体前发酵，转化银杏内酯和银杏黄酮，通过后发酵，使槲皮素和银杏内酯B得以分离，可实现工业化大规模生产，并可以同时生产银杏内酯B和槲皮素；工艺简单，且所得到的产品中，银杏内酯B纯度大于90%，槲皮素纯度大于95%，制取的纯度较高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种利用粗皮韧革菌同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法。
技术介绍
目前，研究证明银杏内酯是银杏叶中主要的活性成分之一，是一类特异有效的血小板活化因子(Platelet activating factor)受体拮抗剂。血小板活化因子(PAF)是由血小板和多种炎症组织分泌产生的一种内源性磷酯，是目前发现的最有效的血小板聚集诱导剂，与许多疾病的产生、发展密切相关。银杏内酯作为PAF受体特异性拮抗剂，具有广泛的药理作用。研究发现银杏内酯B对中枢神经系统与缺血损伤有保护作用，抗休克、抗过敏、抗菌抗炎作用，以及抗器官移植中的排斥反应。同时还发现银杏内酯B可降低肝门静脉压，提高全身血管耐受性，说明它对肝硬化有一定的疗效。银杏内酯对于肾损伤有治疗作用。这些作用都与银杏内酯B作为PAF受体拮抗剂有关，并且它目前被认为是作用最强的、最有临床应用前景的天然血小板活化因子(PAF)受体拮抗剂。 槲皮素及其衍生物是植物界分布广泛的，具有多种生物学活性的黄酮类化合物。近年来，国内外医药工作者对槲皮素的研究日益增多，发现其具有许多药理活性，如抗氧化及清除氧自由基作用、抗纤维化作用、抗肿瘤作用、能降低血压，保护心肌缺血再灌注损伤、抗病毒、镇痛及止泻等，并且槲皮素对人体无毒、 无害、无致癌、无致死、无致畸等优点，国外曾试用于多种疾病的治疗，取得了良好的效果。槲皮素存在于许多植物的花、叶、果实中，多以甙的形式存在，如芦丁、槲皮甙、金丝桃甙等，这些甙通常经酸水解制备槲皮素。极少用生物的方法制备槲皮素。近年来有学者提出了中药发酵制药技术。所谓的中药发酵制药技术是在继承中药炮制学发酵法的基础上，吸取了微生态学研究成果，结合现代生物工程的发酵技术而形成的高科技中药制药新技术，是从中药（天然药物）制药方面寻找药物的新疗效。传统的中药发酵多是在天然的条件下进行的，而现在的中药发酵制药技术是在充分吸收了近代微生态学、生物工程学的研究成果而逐渐形成的。现有技术中普遍采用对银杏内酯B和槲皮素分别利用单纯的分离提纯方法来获得大量的银杏内酯B和槲皮素，分离效率低下，不能适用于工业化大规模生产，并且单独提纯分离方法较落后，生产成本较高。本案专利技术人经过深入研究和反复工业化生产试验，摸索出工业化规模同时生产银杏内酯B和槲皮素技术，本专利技术无论从产品的生产方式和生产的产品，都有别于以往的专利和文章报道的内容，即一种利用粗皮韧革菌同时生产银杏内酯B和槲皮素的方法。
技术实现思路
、要解决的问题针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供一种利用粗皮韧革菌同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，其以去皮白果和大米为固体基质添加银杏叶提取物，以粗皮韧革菌为菌种通过固体前发酵，转化银杏内酯和银杏黄酮，通过后发酵，使槲皮素和银杏内酯B得以分离，可实现工业化大规模生产，并可以同时生产银杏内酯B和槲皮素；工艺简单，且所得到的产品中，银杏内酯B纯度大于90%，槲皮素纯度大于95%，制取的纯度较高。、技术方案为了解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下：所述的一种利用粗皮韧革菌同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，所述制备方法以大米、去皮白果和银杏叶提取物为主要原料，以粗皮韧革菌为出发菌株，依次经过试管扩大培养、液体摇瓶培养和种子罐扩大培养、固体前发酵培养、液体后发酵培养及提取分离步骤制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体；所述含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体再分别经过提取制得银杏内酯B和槲皮素晶体，其中银杏内酯B纯度达到90%，槲皮素纯度达到95%。一种利用粗皮韧革菌同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，按照下述步骤进行：A1试管扩大培养：将粗皮韧革菌（Stereum hirsutum）中斜面菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中进行培养，制得粗皮韧革菌试管斜面菌种；A2液体摇瓶培养：将步骤A1所制得的粗皮韧革菌试管斜面菌种接种到装有液体摇瓶培养基的摇瓶中，进行培养，制得粗皮韧革菌液体摇瓶菌种；A3种子罐扩大培养：将步骤A2所制得的粗皮韧革菌液体摇瓶菌种接种到种子罐培养基中进行培养，制成粗皮韧革菌种子罐菌种；A4固体前发酵培养：将步骤A3所制得的粗皮韧革菌种子罐菌种接种到固体培养基中，并混合均匀，进行发酵培养，制得粗皮韧革菌固体发酵物；A5液体后发酵培养：将步骤A4所制得的粗皮韧革菌固体前发酵物转移到液体发酵罐培养基中，进行液体后发酵，制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的粗皮韧革菌菌丝体；A6提取分离：将步骤A5所制得的含有槲皮素的粗皮韧革菌菌丝体和含有银杏内酯B的发酵液分别经过提取，得到槲皮素和银杏内酯B 晶体。优选地，一种利用粗皮韧革菌同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，按照下述步骤进行：B1试管扩大培养：将粗皮韧革菌试管中斜面菌种切成3×3 mm小块菌种，接种一小块到试管斜面培养基中，20～35℃培养4～15天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；B2液体摇瓶培养：将步骤B1所制得的试管斜面菌种切成3×3 mm小块菌种，挑取3～10块接种于装有20～150mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为50～200转/分，温度20～35℃的条件下，摇床培养18-86h，制成液体摇瓶菌种；B3种子罐扩大培养：将步骤B2所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为1～20%的接种量接种，在温度为20～35℃，搅拌转速为50～160转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.2～1.8:1的通气量条件下，培养18～96h，制成粗皮韧革菌种子罐菌种；B4固体前发酵培养：将步骤B3所制得的粗皮韧革菌种子罐菌种接入装有固体前发酵培养基的培养袋中，且所述粗皮韧革菌种子罐菌种与装有固体前发酵培养基的培养袋按体积比为2～10%的接种量接种，在温度20～35℃，湿度80%前发酵20～40天，其中每隔3～6天，翻袋一次，制得固体前发酵物；B5液体后发酵培养：将步骤B4所制得的固体前发酵物粉碎至20目，加入到液体发酵罐培养基中，所述液体发酵罐培养基体积与固体前发酵物的重量比为5～10，在温度为20～43℃，搅拌转速为50～160转/分，在每分钟通入气体的体积与液体发酵罐培养基体积比为0.2-1.8:1的通气量条件下发酵24～72h，所制得的发酵液体在2000～6000转/分钟条件下离心制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体；B6提取分离：将步骤A5所制得的含有槲皮素的粗皮韧革菌菌丝体和含有银杏内酯B的发酵液分别经过提取，得到槲皮素和银杏内酯B 晶体。优选地，步骤B2中所述液体摇瓶培养基是在100～130℃条件下灭菌90～360 min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮5～20g，大米5～20g的原料。优选地，步骤B3中所述种子罐扩大培养基是在100～130℃条件下灭菌90～360 min制得，且每升液体摇瓶培养基中含有麸皮5～20g，大米5～20g的原料。优选地，步骤B4中所述固体前发酵培养基是在100～130℃条件下灭菌90～360 min制得，且每一千克固体前发酵培养基中含有去皮白果200～400g、银杏叶提取物30～50g和大米750～570g的原料。优选地，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用粗皮韧革菌同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，其特征在于，所述制备方法以大米、去皮白果和银杏叶提取物为主要原料，以粗皮韧革菌为出发菌株，依次经过试管扩大培养、液体摇瓶培养和种子罐扩大培养、固体前发酵培养、液体后发酵培养及提取分离步骤制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体；所述含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体再分别经过提取制得银杏内酯B和槲皮素晶体，其中银杏内酯B纯度达到90%，槲皮素纯度达到95%。

【技术特征摘要】
1.一种利用粗皮韧革菌同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，其特征在于，所述制备方法以大米、去皮白果和银杏叶提取物为主要原料，以粗皮韧革菌为出发菌株，依次经过试管扩大培养、液体摇瓶培养和种子罐扩大培养、固体前发酵培养、液体后发酵培养及提取分离步骤制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体；所述含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的菌丝体再分别经过提取制得银杏内酯B和槲皮素晶体，其中银杏内酯B纯度达到90%，槲皮素纯度达到95%。2.根据权利要求1所述的一种利用粗皮韧革菌同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：A1试管扩大培养：将粗皮韧革菌中斜面菌种接种于马铃薯葡萄糖培养基中进行培养，制得粗皮韧革菌试管斜面菌种；A2液体摇瓶培养：将步骤A1所制得的粗皮韧革菌试管斜面菌种接种到装有液体摇瓶培养基的摇瓶中，进行培养，制得粗皮韧革菌液体摇瓶菌种；A3种子罐扩大培养：将步骤A2所制得的粗皮韧革菌液体摇瓶菌种接种到种子罐培养基中进行培养，制成粗皮韧革菌种子罐菌种；A4固体前发酵培养：将步骤A3所制得的粗皮韧革菌种子罐菌种接种到固体培养基中，并混合均匀，进行发酵培养，制得粗皮韧革菌固体发酵物；A5液体后发酵培养：将步骤A4所制得的粗皮韧革菌固体前发酵物转移到液体发酵罐培养基中，进行液体后发酵，制得含有银杏内酯B的发酵液和含有槲皮素的粗皮韧革菌菌丝体；A6提取分离：将步骤A5所制得的含有槲皮素的粗皮韧革菌菌丝体和含有银杏内酯B的发酵液分别经过提取，得到槲皮素和银杏内酯B 晶体。3.根据权利要求2所述的一种利用粗皮韧革菌同时制备银杏内酯B和槲皮素的方法，其特征在于，所述制备方法具体如下：B1试管扩大培养：将粗皮韧革菌试管中斜面菌种切成3×3 mm小块菌种，接种一小块到试管斜面培养基中，20～35℃培养4～15天，制得试管斜面菌种，该试管斜面4℃保存备用；B2液体摇瓶培养：将步骤B1所制得的试管斜面菌种切成3×3 mm小块菌种，挑取3～10块接种于装有20～150mL液体摇瓶培养基的250mL三角瓶中，三角瓶在转速为50～200转/分，温度20～35℃的条件下，摇床培养18-86h，制成液体摇瓶菌种；B3种子罐扩大培养：将步骤B2所制得的液体摇瓶菌种接种于种子罐扩大培养基中，且所述液体摇瓶菌种与种子罐扩大培养基按体积比为1～20%的接种量接种，在温度为20～35℃，搅拌转速为50～160转/分，在每分钟通入气体的体积与种子罐扩大培养基体积比为0.2～1.8:1的通气量条件下，培养18～96h，制成粗皮韧革菌种子罐菌种；B4固体前发酵培养：将步骤B3所制得的粗皮韧革菌种子罐菌种接入装有固体前发酵培养基的培养袋中，且所述粗皮韧革菌种子罐菌种与装有固体前发酵培养基的培养袋按体积比为2～10%的接种量接种，在温度20～35℃，湿度80%前发酵20～40天，其中每隔3～6天，翻袋一次，制得固体前发酵物；B5液体后发酵培养：将步骤B4所制得的固体前发酵物粉碎至20目，加入到液体发酵罐培养基中，所述液体发酵罐培养基体积与固体前发酵物的重量比为5～10，在温度为20～43℃，搅拌转速为50～160转...

【专利技术属性】
技术研发人员：张志才，李金花，樊亚娟，胡坤雅，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32