一种乙醛‑DNA加合物的测定方法技术

一种乙醛‑DNA加合物的测定方法，即DNA中Ethylidene‑dG和Propano‑dG的测定方法，包括采用乙醛溶液暴露小牛胸腺DNA并加入精氨酸作为反应的催化剂，DNA溶液进行酶水解并依次加入稳定同位素内标、还原剂NaBH3CN和DNA水解酶。水解液经Strata‑X小柱固相萃取，收集洗脱液并引入LC‑MS/MS系统分析，可准确检测出Et‑dG和Propano‑dG的含量水平。本发明专利技术为全新的DNA中乙醛‑DNA加合物的测定方法，采用稳定同位素作为内标定量分析物可以减少样品前处理过程中引起的误差，串联质谱法更好的提高了方法的选择性、准确性和灵敏度。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间，减少了有机溶剂的消耗量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于DNA样本的理化检验
，主要涉及DNA中N2-亚乙基-鸟嘌呤（Ethylidene-dG）和1,N2-丙醇-鸟嘌呤（Propano-dG）加合物的测定
，具体说是一种采用液相色谱-串联质谱仪（LC- MS/MS）测定DNA中乙醛-DNA加合物的方法。
技术介绍
乙醛是一种广泛存在于环境基质中的污染物。主要产生于有机物的不完全燃烧，如工业生产、卷烟烟气、机动车尾气等。活泼的醛基不需要经过机体代谢就能够直接攻击生物体内亲核基团，如核酸中的鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶形成DNA加合物。乙醛形成的主要DNA加合物包括N2-亚乙基-鸟嘌呤（Ethylidene-dG）和1,N2-丙醇-鸟嘌呤（Propano-dG），其中1,N2-丙醇-鸟嘌呤（Propano-dG）是由Ethylidene-dG与乙醛进一步反应所得，该过程需要氨基酸的催化。N2-亚乙基-鸟嘌呤（Ethylidene-dG）在单核苷酸状态下不稳定，需要将其在DNA酶水解阶段还原为N2-乙基-鸟嘌呤（Et-dG）才能被检出。目前，关于DNA加合物的分析检测方法报道的较多，主要有32P-后标记技术、酶联免疫技术（ELISA）、高效液相色谱法（HPLC-UV）和液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）。其中LC-MS/MS由于其较高的灵敏度和选择性被广泛应用于DNA加合物的检测分析。
技术实现思路
本专利技术的目的正是基于上述现有技术状况而采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术建立的乙醛-DNA加合物（Ethylidene-dG和Propano-dG）的测定方法。该方法具有快速、准确、灵敏度高等特点，可用于DNA中乙醛-DNA加合物的同时定性定量分析。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种乙醛-DNA加合物的测定方法，即DNA中Ethylidene-dG和Propano-dG的测定方法，具体步骤如下：a、乙醛暴露小牛胸腺DNA：取400 μg小牛胸腺DNA，加入配制好的乙醛溶液（乙醛溶液用0.1 M的PBS溶液配制，浓度0.001-1 mM），对照组加入同等体积的PBS溶液。上述溶液中各加入8.0 mg的精氨酸，放入37℃恒温培养箱中24 h；使用2倍体积的冰乙醇沉淀DNA并终止反应，离心去掉上清液，用70%的乙醇水清洗DNA样品，得到的DNA团块晾干并加入200 μL超纯水复溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位（OD）相当于50 μg/mL。b、DNA的酶水解及固相萃取（SPE）：将上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl2缓冲液（pH=7）中，加入30 mg的还原剂 NaBH3CN，将Ethylidene-dG还原为Et-dG；加入20 μL混合内标，加入60U脱氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和30U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h。水解液经1 mL甲醇活化和1 mL超纯水平衡的Strata-X固相萃取小柱，用1 mL超纯水和1 mL 10%的甲醇水淋洗，最后用1 mL 50%的甲醇水洗脱，收集洗脱液即为样品待测液。此过程的目的是为了使双链DNA酶解成单核苷酸状态，通过固相萃取和氮吹浓缩纯化分离并富集所需的DNA加合物。所述混合内标为100 ng/mL的[15N5]Et-dG和[15N5]Propano-dG。c、标准工作液的配制：用甲醇分别配制不同浓度的Et-dG和Propano-dG标准工作溶液。d、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。色谱条件：选取Thermo AcclaimTM Polar Advantage II C18 色谱柱（4.6×150 mm，3 μm），流动相体系选取甲醇（A）和纯水（B），洗脱条件为等度洗脱：0-15 min：35% A；流速为0.40 mL/min，进样量为5 μL。质谱条件：电喷雾离子源（ESI），多反应监测正离子扫描方式；喷雾电压：5500 V，离子源温度：550℃，气帘气的量为20 psi，雾化气为70 psi，干燥气为75 psi，碰撞气为9 psi，射入电压：10 V，碰撞能：9 eV，驻留时间：200 ms。监测离子对为Et-dG：296.2→180.2定量离子对，296.2→117.2定性离子对；内标[15N5]Et-dG为271.2→155.2；Propano-dG：338.3→222.1定量离子对，338.3→117.2定性离子对；内标[15N5]Propano-dG为343.2→227.2。分析物及内标的MRM参数见表1。整个分析过程由Applied Biosystems Analyst version 1.5.1 软件来控制。表1 多反应监测模式下分析物及其内标的MRM参数*为定量离子本专利技术方法的线性范围和检出限：将系列标准工作溶液注入LC-MS/MS，得到标准工作曲线、线性回归方程以及相关系数。Et-dG和Propano-dG标准曲线的点为0.02，0.05，0.1，0.2，1.0，1.5和2.0 ng/mL。目标物的线性良好，相关系数均大于0.9999。利用加标稀释得到方法的定量限和检出限，目标峰十倍信噪比对应的浓度为定量限，三倍信噪比对应的浓度为检出限。分析物的标准曲线及定量限和检出限见表2。表2 目标物的标准工作曲线及LOD和LOQ本专利技术方法加标回收率和重复性：采取小牛胸腺DNA样本中加标的方法获得方法的加标回收率，总共选取了三个添加水平，每个添加水平重复测定3次，得到的方法的回收率和重复性，结果见表3。目标物的回收率在97.2%-101.6%之间，RSD小于10%，证明方法的准确性和重复性结果较好。表3 分析物的加标回收率和重复性本专利技术的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对DNA中乙醛-DNA加合物的色谱条件进行了优化，并对LC-MS/MS的相关检测条件进行了优化。与现有技术相比本专利技术方法具有如下优良效果：①与传统的液相色谱方法比较，由于选取了串联质谱，使得方法的选择性和灵敏度提高，更有利于DNA中低含量的乙醛-DNA加合物的测定。②本方法具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。③本专利技术方法采用稳定同位素作为内标定量分析物可以减少样品前处理过程中引起的误差，串联质谱法更好的提高了方法的选择性与准确性和灵敏度。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间，减少了有机溶剂的消耗量。附图说明图1 乙醛-DNA加合物的总离子流图。图2 不同乙醛暴露剂量下，小牛胸腺DNA中Et-dG和Propano-dG含量。具体实施方式本专利技术以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本专利技术。一种DNA中乙醛-DNA加合物的测定方法，其测试过程是用乙醛溶液对小牛胸腺DNA进行暴露（精氨酸作为催化剂），对DNA溶液进行酶水解并加入还原剂NaBH3C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙醛‑DNA加合物的测定方法，即N2‑亚乙基‑鸟嘌呤（Ethylidene‑dG）、1,N2‑丙醇‑鸟嘌呤（Propano‑dG）的测定方法，其特征在于：包括以下具体步骤：a、乙醛暴露小牛胸腺DNA：取400 μg小牛胸腺DNA，加入配制好的乙醛溶液，对照组加入同等体积的PBS溶液，上述溶液中各加入8.0 mg的精氨酸，放入37℃恒温培养箱中24 h；使用2倍体积的冰乙醇沉淀DNA并终止反应，离心去掉上清液，用70%的乙醇水溶液清洗DNA样品，得到的DNA团块晾干并加入200 μL超纯水复溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位（OD）相当于50 μg/mL；b、DNA的酶水解及固相萃取（SPE）：将上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris‑HCl/5 mM MgCl2缓冲液中，加入30 mg 的还原剂NaBH3CN，将N2‑亚乙基‑鸟嘌呤（Ethylidene‑dG）还原成N2‑乙基‑鸟嘌呤（Et‑dG）来检测，加入20 μL混合内标，加入60U脱氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和30U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h，水解液经1 mL甲醇活化和1 mL超纯水平衡的Strata‑X固相萃取小柱，用1 mL超纯水和1 mL 10%的甲醇水淋洗，最后用1 mL 50%的甲醇水洗脱，收集洗脱液即为样品待测液；c、标准工作液的配制：用甲醇配制不同浓度的N2‑乙基‑鸟嘌呤（Et‑dG）、1,N2‑丙醇‑鸟嘌呤（Propano‑dG）标准工作溶液；d、液相色谱‑串联质谱（LC‑MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液，注入LC‑MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。...

【技术特征摘要】
1.一种乙醛-DNA加合物的测定方法，即N2-亚乙基-鸟嘌呤（Ethylidene-dG）、1,N2-丙醇-鸟嘌呤（Propano-dG）的测定方法，其特征在于：包括以下具体步骤：a、乙醛暴露小牛胸腺DNA：取400 μg小牛胸腺DNA，加入配制好的乙醛溶液，对照组加入同等体积的PBS溶液，上述溶液中各加入8.0 mg的精氨酸，放入37℃恒温培养箱中24 h；使用2倍体积的冰乙醇沉淀DNA并终止反应，离心去掉上清液，用70%的乙醇水溶液清洗DNA样品，得到的DNA团块晾干并加入200 μL超纯水复溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位（OD）相当于50 μg/mL；b、DNA的酶水解及固相萃取（SPE）：将上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl2缓冲液中，加入30 mg 的还原剂NaBH3CN，将N2-亚乙基-鸟嘌呤（Ethylidene-dG）还原成N2-乙基-鸟嘌呤（Et-dG）来检测，加入20 μL混合内标，加入60U脱氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和30U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h，水解液经1 mL甲醇活化和1 mL超纯水平衡的Strata-X固相萃取小柱，用1 mL超纯水和1 mL 10%的甲醇水淋洗，最后用1 mL 50%的甲醇水洗脱，收集洗脱液即为样品待测液；c、标准工作液的配制：用甲醇配制不同浓度的N2-乙基-鸟嘌呤（Et-dG）、1,N2-丙醇-鸟嘌呤（Propano-dG）标准工作溶液；d、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈欢，侯宏卫，胡清源，刘鲁娟，朱贝贝，陈建，王红娟，
申请(专利权)人：国家烟草质量监督检验中心，
类型：发明
国别省市：河南;41