本发明专利技术提供了2,4‑二硝基苯磺酰胺衍生物及其在检测硫醇中的应用，所述的2,4‑二硝基苯磺酰胺衍生物是(E)‑N‑(4‑(4‑(二苯基氨基)苯乙烯基)苯基)‑2,4‑二硝基苯磺酰胺，简称：DSPDF。将DSPDF作为检测试剂用于检测硫醇，是在pH为7.4的HEPES缓冲溶液中，利用巯基能将酰胺键断裂产生氨基，发生荧光增强，实现对生物硫醇的检测。该检测方法，对生物硫醇显示了高的灵敏性和选择性，检测试剂廉价、检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物硫醇检测技术，具体属于一种以2,4-二硝基苯磺酰氯衍生物，以及将其作为荧光试剂，快速、定量荧光检测生物硫醇的方法。
技术介绍
生物体内硫醇水平的改变与很多疾病密切相关，如牛皮癣、癌症和艾滋病。体内缺乏半胱氨酸(Cys)会导致很多病症，如儿童生长缓慢，皮肤损伤，头发掉色，肝脏水肿。_血液中高浓度的同型半胱氨酸(Hcy)是冠心病和脑梗塞的独立致病因素。谷胱甘肽(GSH)是细胞内最富裕的非蛋白质硫醇，在维持细胞的氧化还原动态平衡中起着重要作用，而且谷胱甘肽的水平还与许多疾病和癌症有着直接的联系。因此，定量检测生物体系中硫醇的浓度在生物化学和临床化学中具有重要意义。荧光检测具有灵敏度高、检出限低，能够在单体或者细胞内实现可视化追踪，因而成为了目前检测生物体内硫醇类物质的一种重要手段。因此，发展用商业可得、廉价的试剂，操作方便、选择性高、灵敏度高的生物硫醇定量检测方法尤为重要。
技术实现思路
：本专利技术的目的是为了克服现有技术生物硫醇检测中存在的问题，提供一种体系廉价、操作方便、选择性高、灵敏度高的荧光检测生物硫醇的试剂和方法。本专利技术提供的一种2,4-二硝基苯磺酰胺的衍生物，它是(E)-N-(4-(4-(diphenylamino)styryl)phenyl)-2,4-dinitrobenzenesulfonamide(简称：DSPDF)，中文名(E)-N-(4-(4-(二苯基氨基)苯乙烯基)苯基)-2,4-二硝基苯磺酰胺。其结构式是：DSPDF的合成方法，步骤为：将2,4-二硝基苯磺酰氯与(E)-4-(4-氨基苯乙烯)-N，N-二苯基氨基按摩尔比1︰1完全溶解在CH2Cl2中，逐渐滴加三乙胺，控制温度在0℃～5℃的冰水浴条件下反应8小时，反应完成后，抽滤，水洗，干燥，过柱得到棕黄色固体即为(E)-N-(4-(4-(二苯基氨基)苯乙烯基)苯基)-2,4-二硝基苯磺酰胺。所述的2,4-二硝基苯磺酰胺的衍生物可用作检测生物硫醇的试剂。本专利技术提供的一种检测硫醇的方法，是基于2,4-二硝基苯磺酰胺的衍生物，在pH为7.4的HEPES溶液中定量地检测硫醇的含量。该检测方法，对硫醇显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。具体检测步骤为：(1)、配制pH＝7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，并用DMSO配制2mM DSPDF的DMSO溶液。(2)、按体积比1:1将HEPES缓冲溶液和DSPDF的DMSO溶液加到干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，440nm的荧光强度逐渐增强；(3)、用蒸馏水配制2mM的Cys溶液，把2mL的HEPES缓冲溶液和DSPDF的DMSO溶液加到荧光比色皿中，逐渐加入Cys溶液的体积为6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78μL，同时在荧光光谱仪上测定440nm的对应的荧光强度F为428.6、712.2、997.5、1292、1612、1920、2219、2494、2726、2947，3218、3431,、3614，以Cys浓度为横坐标，以相对荧光强度F0-F为纵坐标绘制图，F0﹦133.7，得到Cys浓度的工作曲线；线性回归方程为：F0-F＝0.9049+45.1972c，c的单位为10-6mol/L；(4)、测定样品溶液时，将测得的荧光强度代入线性回归方程，即可求得Cys,的浓度。经实验证明，其它分析物不干扰体系对生物硫醇的测定。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和效果：1、试剂易于合成且廉价，检测体系成本低廉；2、本专利技术的检测方法，对生物硫醇显示了高的灵敏性和选择性；3、检测手段简单，只需要借助荧光光谱仪即可实现。附图说明：图1a实施例1制备的DSPDF的核磁氢谱图1b实施例1制备的DSPDF的核磁碳谱图1c实施例1制备的DSPDF的质谱图图2实施例2DSPDF与Cys作用的荧光发射图图3实施例3DSPDF与各种分析物的荧光柱状图图4实施例4工作曲线图5实施例5细胞成像图具体实施方式：实施例10.543g 2,4-二硝基苯磺酰氯与0.598(E)-4-(4-氨基苯乙烯)-N，N-二苯基氨基按摩尔比1︰1完全溶解在CH2Cl2中，逐渐滴加三乙胺0.362g，控制温度在0℃～5℃的冰水浴条件下反应8小时，反应完成后，抽滤，水洗，干燥，过柱得到棕黄色固体即为(E)-N-(4-(4-(二苯基氨基)苯乙烯基)苯基)-2,4-二硝基苯磺酰胺。1H NMR(DMSO-d6,600MHz):δ(ppm):11.12(s,1H),8.90(s,1H),8.61(d,J＝8.0Hz,1H),8.23(d,J＝8.5Hz,1H),7.48(dd,J＝20.4,6.9Hz,4H),7.31(d,J＝6.7Hz,4H),7.16–7.00(m,10H),6.94(d,J＝7.0Hz,2H)(图1a).13C NMR(DMSO-d6,150MHz):δ(ppm):130.06(s),128.05(s),127.73(s),124.62(s),123.76(s),123.42(s),121.80(s),40.48(d,J＝18.3Hz),40.28(s),40.14(s),40.00(s),39.86(s),39.72(s),39.59(s)(图1b).ESI–MS m/z:[探针+H]+Calcd.For C32H25N4O6S 592.14,Found 591.67(图1c).实施例2配制pH＝7.0、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，并用DMSO配制2mM DSPDF的溶液；把2mL的HEPES缓冲溶液及10μL DSPDF的DMSO溶液加到干净的荧光比色皿中，取Cys的溶液，逐渐用微量进样器加到此比色皿中，边加样边在荧光分光光度仪上检测，随着Cys的加入，440nm处荧光强度逐渐增强。荧光发射图见图2。实施例3配制pH＝7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，并用DMSO配制2mM的DSPDF溶液；在22个荧光比色皿中，各加入2mL的HEPES-DMSO(1:1，pH 7.4)溶液和10μL的DSPDF的DMSO溶液，再分别加入8摩尔当量Cys，Hcy，GSH，以及50摩尔当量的各种分析物：Ala,Arg,Asn,Asp,Gln,Glu,Gly,His,IIe,Leu，Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr,VaL在荧光分光光度仪上检测，绘制不同分析物对应的440nm相对荧光强度的柱状图(见图3)。硫醇使得DSPDF的荧光强度明显增强，其它的分析物基本没有引起DSPDF荧光强度的变化。经实验证明，其它分析物不干扰体系对硫醇的测定。实施例4配制pH＝7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，并用DMSO配制2mM的DSPDF溶液，用蒸馏水配制2mM的Cys溶液；把2mL的HEPES-DMSO(1:1，pH 7.4)溶液和10μL的DSPDF
的DMSO溶液加到荧光比色皿中，分别再加入Cys溶液的体积为6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78μL时，在荧光分光光度仪上测定440nm对应的荧光强度F为428.6、712.2、9本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种2,4‑二硝基苯磺酰胺衍生物，简称为DSPDF，其特征在于，结构式为：
【技术特征摘要】
1.一种2,4-二硝基苯磺酰胺衍生物，简称为DSPDF，其特征在于，结构式为：2.如权利要求1所述的一种2,4-二硝基苯磺酰胺衍生物的合成方法，其特征在于，步骤为：将2,4-二硝基苯磺酰氯与(E)-4-(4-氨基苯乙烯)-N，N-二苯基氨基按摩尔比1︰1完全溶解在CH2Cl2中，逐渐滴加三乙胺，控制温度在0℃～5℃的冰水浴条件下反应8小时，反应完成后，抽滤，水洗，干燥，过柱得到棕黄色固体即为(E)-N-(4-(4-(二苯基氨基)苯乙烯基)苯基)-2,4-二硝基苯磺酰胺。3.如权利要求1所述的2,4-二硝基苯磺酰胺衍生物用作检测硫醇的试剂。4.一种检测硫醇的方法：其特征在于，步骤为：(1)、配制pH＝7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，并用DMSO配制2mM DSPDF的DMSO溶液。(2)、按体积比1:1将HEPES缓冲溶液和DSPDF的DMSO溶液加到干...
【专利技术属性】
技术研发人员：阴彩霞，张伟杰，霍方俊，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西;14
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