本发明专利技术公开了一种基于ZEB‑1和ZEB‑2作为标记物预警乳腺癌转移的方法,首先提取手术后的乳腺癌患者肿瘤组织制成石蜡标本，对石蜡标本进行切片和HE染色，然后分别采用免疫组织化学法和分子杂交技术检测肿瘤组织中ZEB‑1、ZEB‑2的蛋白表达和mRNA表达，若患者肿瘤组织中ZEB‑1、ZEB‑2的蛋白表达和/或mRNA表达呈阳性，则提示患者的乳腺癌肿瘤发生转移和复发。本发明专利技术通过将ZEB‑1和ZEB‑2作为标记物，对患者乳腺癌转移和复发进行预警，为乳腺癌的合理治疗提供新依据，从而可以对乳腺癌患者进行针对性治疗，大大提高了治疗效果，改善了患者的预后，进而提高了患者的生活质量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学病理学
，涉及一种预警乳腺癌肿瘤转移和复发的标记物，具体是一种基于ZEB-1和ZEB-2作为标记物预警乳腺癌转移的方法。
技术介绍
肿瘤的侵袭和转移是肿瘤细胞、宿主细胞及细胞外基质之间的一系列复杂、多步骤相互作用的结果，是一个多阶梯瀑布进程。其中，尤以病灶局部基底膜完整性的破坏、细胞外基质降解和肿瘤细胞上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transitions，EMT)两个方面是肿瘤发生侵袭转移的重要条件。EMT在肿瘤演进过程中发挥了重要作用，它是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间充质细胞分化的现象，研究发现晶状体上皮细胞在胶原凝胶中可形成伪足，转变为间质细胞样形态，获得移行能力。EMT的核心就是E-钙粘蛋白(E-cadherin)的缺失，导致上皮细胞失去极性和细胞与细胞间的粘附作用不稳定，以及细胞骨架、细胞角蛋白(cytokeratin)、波形蛋白(Vimentin)的改变，并使β-环连蛋白从复合体上解离，从而实现肿瘤细胞从原发灶中的分离。通过对胚胎发育的研究证实，EMT是一个可逆的过程，当脱落肿瘤细胞到达异位器官后会再分化，发生间质-上皮转化(Mesenchymal-epithelial transitions，MET)，以长期存活并形成为转移灶。ZEB-1(zinc-finger E-box-binding homeobox-1)和ZEB-2(zinc-finger E-box-binding homeobox-2)都是锌指结构蛋白，广泛的存在于各种生物体内，是一类核转录因子，能够调控下游靶基因的
转录，ZEB-1和ZEB-2均可通过与E-钙粘蛋白上保守的E2-boxes结合使其转录下调，从而导致EMT。目前，对于乳腺癌手术后患者进行治疗(放疗或药物治疗)的原则主要根据手术切除肿瘤组织的病理学检查(如淋巴结转移状况、雌孕激素表达状况、临床分期等)和患者自身身体状况等做出。在术后治疗过程中，由于缺乏预测、预警和早期发现体内转移和复发灶的生物学标志物，丧失了针对性治疗的最佳良机。一旦等到临床上发现转移灶或复发灶(如乳腺癌骨转移、脑转移等)，患者已经达到癌症晚期，治疗效果和机体耐受治疗的能力已经大打折扣，同时也大大增加了患者的痛苦和经济负担。现有的标记物如CA15.3,CA27.29和CEA等由于敏感性和特异性不高，尚未在临床诊疗中应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于ZEB-1和ZEB-2作为标记物预警乳腺癌转移的方法，为提示乳腺癌转移和复发提供生物学标记物，从而为乳腺癌的合理治疗提供新依据。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：基于ZEB-1和ZEB-2作为标记物预警乳腺癌转移的方法，该方法将ZEB-1和ZEB-2作为标记物，对乳腺癌转移进行监测和预警；该方法包括如下步骤:A.提取手术后的乳腺癌患者肿瘤组织制成石蜡标本；B.对石蜡标本进行4μm厚连续切片，对切片采用HE染色；C.采用免疫组织化学法检测肿瘤组织中ZEB-1、ZEB-2的蛋白表达；D.采用原位分子杂交技术检测肿瘤组织中ZEB-1和ZEB-2的mRNA表
达；E.分别观察经过免疫组织化学法检测和原位分子杂交技术检测的患者肿瘤组织切片，两种方法检测的ZEB-1、ZEB-2指标均以肿瘤组织细胞核和/或细胞浆呈黄色或棕黄色记为阳性表达，若患者肿瘤组织中ZEB-1、ZEB-2的蛋白表达和/或mRNA表达呈阳性，则提示患者的乳腺癌肿瘤发生转移和复发。进一步地，所述的免疫组织化学法包括以下步骤：a.将石蜡切片放入60℃恒温烤箱，烘烤时间为2小时以上；b.将切片脱蜡与水化：将切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；置于无水乙醇中浸泡5分钟；置入95％乙醇中浸泡5分钟；置入70％乙醇中浸泡5分钟；置入蒸馏水中浸泡5分钟；c.采用柠檬酸盐缓冲液高压抗原修复法进行抗原修复：将脱蜡水化的组织切片置于耐高温切片架上，同时将PH 6.0的柠檬酸盐缓冲液在高压锅中加热至沸腾，再将切片架放入已沸腾的缓冲液中，关闭高压锅直至开始喷气时，盖上压力阀，2分钟后，将高压锅置入凉水中冷却直至室温，将切片取出；d.用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟；e.切片分别滴加50ul ZEB-1和ZEB-2的一抗试剂，置于4℃环境下过夜；f.次日复温30分钟后，用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，然后甩去PBS缓冲液；g.滴加二抗试剂，二抗试剂采用快捷型酶标羊抗和鼠IgG聚合物，在37℃环境下孵育20分钟；h.用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，然后甩去PBS缓冲液；i.每张切片滴加50ul DAB溶液，避光显色3-10分钟，在显微镜下控制显色；j.置于水下充分冲洗，采用苏木精复染，用自来水冲洗返蓝；k.将切片经梯度酒精干燥，用二甲苯透明，最后用中性树胶封片。进一步地，所述的原位分子杂交技术包括以下步骤：a.将石蜡切片放入60℃恒温烤箱过夜；b.将切片脱蜡与水化：将切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；置于无水乙醇中浸泡5分钟；置入95％乙醇中浸泡5分钟；置入70％乙醇中浸泡5分钟；置入DEPC水中浸泡5分钟；c.用0.5M PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟；d.用3％双氧水室温作用10分钟，用DEPC水冲洗3次，每次冲洗5分钟；e.用3％柠檬酸稀释的胃蛋白酶在37℃环境下消化20分钟；f.用0.5M PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，用DEPC水冲洗1次；g.滴加预杂交液50ul/片，置入40℃-42℃恒温箱4小时，然后甩去多余液体；h.再次滴加杂交液50ul/片，置入40℃-42℃恒温箱16-20小时；i.用37℃预温的2×SSC缓冲液冲洗2次，每次冲洗5分钟，再用37℃预温的0.5×SSC缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，再用37℃预温的0.2×SSC缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟；j.滴加封闭液，在37℃环境下放置30分钟，然后甩去多余液体；k.滴加生物素化鼠抗地高辛，在37℃环境下放置60分钟，然后用0.5M PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟；l.滴加SABC，在37℃环境下放置20分钟，然后用0.5M PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟；m.滴加生物素化过氧化物酶，在37℃环境下放置20分钟，然后用0.5M PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，然后甩去PBS缓冲液；n.每张切片滴加100ul DAB溶液，避光显色3-10分钟，在显微镜下控制显色；o.置于水下充分冲洗，采用苏木精复染，用自来水冲洗返蓝；p.将切片经梯度酒精干燥，用二甲苯透明，最后用中性树胶封片。本专利技术的有益效果：本专利技术通过将ZEB-1和ZEB-2作为标记物，对乳腺癌是否转移进行监测和预警，通过采用免疫组织化学法和原位分子杂交技术检测ZEB-1和ZEB-2在肿瘤组织中的表达，监测和预警乳腺癌是否转移和复发，为乳腺癌的合理治疗提供新依据，从而可以对乳腺癌患者进行针对性治疗，大大提高了治疗效果，改善了患者的预后，进而提高了患者的生活质量。附图说明下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细描述。图1是本专利技术实施方法流程简图。具体实施方式本专利技术提供了一种基本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于ZEB‑1和ZEB‑2作为标记物预警乳腺癌转移的方法，其特征在于：该方法将ZEB‑1和ZEB‑2作为标记物，对患者乳腺癌转移和复发进行预警；该方法包括如下步骤:A.提取手术后的乳腺癌患者肿瘤组织制成石蜡标本；B.对石蜡标本进行4μm厚连续切片，对切片采用HE染色；C.采用免疫组织化学法检测患者肿瘤组织中ZEB‑1、ZEB‑2的蛋白表达；D.采用原位分子杂交技术检测患者肿瘤组织中ZEB‑1和ZEB‑2的mRNA表达；E.分别观察经过免疫组织化学法检测和原位分子杂交技术检测的患者肿瘤组织切片，两种方法检测的ZEB‑1、ZEB‑2指标均以肿瘤组织细胞核和/或细胞浆呈黄色或棕黄色记为阳性表达，若患者肿瘤组织中ZEB‑1、ZEB‑2的蛋白表达和/或mRNA表达呈阳性，则提示患者的乳腺癌肿瘤发生转移和复发。
【技术特征摘要】
1.基于ZEB-1和ZEB-2作为标记物预警乳腺癌转移的方法，其特征在于：该方法将ZEB-1和ZEB-2作为标记物，对患者乳腺癌转移和复发进行预警；该方法包括如下步骤:A.提取手术后的乳腺癌患者肿瘤组织制成石蜡标本；B.对石蜡标本进行4μm厚连续切片，对切片采用HE染色；C.采用免疫组织化学法检测患者肿瘤组织中ZEB-1、ZEB-2的蛋白表达；D.采用原位分子杂交技术检测患者肿瘤组织中ZEB-1和ZEB-2的mRNA表达；E.分别观察经过免疫组织化学法检测和原位分子杂交技术检测的患者肿瘤组织切片，两种方法检测的ZEB-1、ZEB-2指标均以肿瘤组织细胞核和/或细胞浆呈黄色或棕黄色记为阳性表达，若患者肿瘤组织中ZEB-1、ZEB-2的蛋白表达和/或mRNA表达呈阳性，则提示患者的乳腺癌肿瘤发生转移和复发。2.根据权利要求1所述的基于ZEB-1和ZEB-2作为标记物预警乳腺癌转移的方法，其特征在于：所述的免疫组织化学法包括以下步骤：a.将石蜡切片放入60℃恒温烤箱，烘烤时间为2小时以上；b.将切片脱蜡与水化：将切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；置于无水乙醇中浸泡5分钟；置入95％乙醇中浸泡5分钟；置入70％乙醇中浸泡5分钟；置入蒸馏水中浸泡5分钟；c.采用柠檬酸盐缓冲液高压抗原修复法进行抗原修复：将脱蜡水化的组织切片置于耐高温切片架上，同时将PH 6.0的柠檬酸盐缓冲液在高压锅
\t中加热至沸腾，再将切片架放入已沸腾的缓冲液中，关闭高压锅直至开始喷气时，盖上压力阀，2分钟后，将高压锅置入凉水中冷却直至室温，将切片取出；d.用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟；e.切片分别滴加50ul ZEB-1和ZEB-2的一抗试剂，置于4℃环境下过夜；f.次日复温30分钟后，用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，然后甩去PBS缓冲液；g.滴加二抗试剂，二抗试剂采用快捷型酶标羊抗和鼠IgG聚合物，在37℃环境下孵育20分钟；h.用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗5分钟，然后甩去PBS缓冲液；i.每张切片滴...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵敏，王瑾，黄金，邹强，昂琳，郑丽，赵洋，胡红光，刘明强，卫宏权，苏明琴，
申请(专利权)人：合肥市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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