本发明专利技术涉及生物技术领域，旨在提供一种分子标记猪瘟病毒弱毒疫苗的构建方法。本发明专利技术以含有猪瘟病毒疫苗C株基因组5’半长的重组质粒pA‑F123和含有BVDV VEDEVAC株Erns基因的重组质粒pE‑B‑Erns为模板，在两端设计20bp同源片段，使用一步定向克隆试剂盒，获得重组pA‑B‑Erns‑F123质粒；用BamH I和Sal I将含有猪瘟病毒疫苗C株基因组3’半长的F456片段从重组质粒pB‑F456中切下，克隆于相同酶作用的pA‑B‑Erns‑F123中，获得重组质粒pA‑B‑Erns‑FL。本发明专利技术的反向遗传操作技术的建立为研究CSFV基因功能和新型疫苗开辟了新的途径。利用反向遗传操作技术将外源标签插入病毒基因组可以用来研究病毒的复制、病毒编码蛋白的功能及抗病毒药物的筛选，使用RNA聚合酶Ⅱ系统能够高效和稳定地拯救猪瘟病毒感染性cDNA克隆。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种分子标记猪瘟病毒弱毒疫苗的构建方法，属于携带牛病毒性腹泻病毒Erns基因的重组猪瘟病毒的拯救和应用领域。
技术介绍
猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一种接触性、致死性传染病，以高热和出血为其典型特征，发病率和死亡率极高，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须申报的动物疫病。猪瘟对养猪业危害严重，常造成巨大经济损失。CSFV是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的成员，CSFV基因组为单股正链线性RNA分子，基因组大小为12.3kb，两端分别为5′端非翻译区(Untranslated Region，UTR)和3′端UTR，中间包含一个大的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，其中ORF编码一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白。该多聚蛋白在病毒感染的宿主细胞内，受宿主或病毒特有的蛋白酶的水解作用，可裂解为11种病毒特异性蛋白，包括4种病毒结构蛋白(C、Erns、E1和E2)和7种非结构蛋白[1]，其中诱导机体产生抗体的蛋白主要是E2和Erns。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)与猪瘟病毒同为瘟病毒属病毒，囊膜蛋白gp48又可称E0或Erns，由227个氨基酸组成，含9个糖基化位点的蛋白，并具有T2RNases活性[2]，其生物学活性与猪瘟病毒Erns具有很多类似之处。经氨基酸序列分析发现Erns保守性高，且其上有中和表位，可用其研究基因工程疫苗，也可作为基因工程诊断抗原。目前，猪瘟疫情的防控主要是对感染猪进行严格扑杀和对周边地区进行消毒，在许多国家和地区，疫苗免疫依然是控制猪瘟的重要手段，而由我国1954年研发的基因1型猪瘟兔化弱毒C株疫苗使用最为广泛。在相当长时间内，由于其性能稳定、免疫效果好，被国内外公认为安全有效的弱毒疫苗。但该疫苗存在一定缺陷：疫苗免疫后不能区分诱导的抗体为免疫动物还是野毒感染。因此，改造和开发能够进行鉴别诊断的新型标记猪瘟弱毒疫苗以及配套的鉴别检测方法成为热点。其中，欧盟多个实验室联合开发的以BVDV CP7株为骨架，将E2基因替换为CSFV Alfort/187株E2基因的重组疫苗CP7-E2alf以及血清学检测方法已经走在前列[3]。然而，由于其骨架为BVDV，免疫后针对BVDV Erns抗体水平低，鉴别诊断还有一定难度，其次，免疫后细胞免疫水平可能不及C-Strain，无法用于紧急免疫，最后，其插入E2基因所属毒株并不在中国流行， 引入存在极大生物安全隐患，因此，开发和研制适合我国猪瘟流行实际情况的新型分子标记疫苗迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种构建分子标记猪瘟病毒弱毒疫苗的方法。为解决技术问题，本专利技术采用的技术方案是：提供一种分子标记猪瘟病毒弱毒疫苗的构建方法，包括以下步骤：(1)扩增牛病毒性腹泻病毒中Erns基因编码区的片段；(2)利用步骤(1)的序列扩增带有20bp猪瘟病毒疫苗C株同源区序列的片段；(3)以重组质粒pA-F123为模板，反向融合PCR获得缺失猪瘟病毒疫苗C株Erns的基因组5＇半长；(4)利用一步定向克隆将步骤(1)和(2)所获得的片段连接到步骤(3)所得质粒，获得携带有BVDV Erns的C株基因组5＇半长的重组pA-B-Erns-F123质粒；(5)将含有猪瘟病毒疫苗C株基因组3＇半长的F456片段从重组质粒pB-F456中切下，克隆于相同酶作用的步骤(4)所得质粒中，获得重组质粒pA-B-Erns-FL；(6)将步骤(5)中获得的重组全长感染性克隆质粒体外转录为RNA，电转至宿主细胞，收获具有感染性的子代病毒粒子并命名为RecC-B-Erns，该子代病毒粒子即为分子标记猪瘟病毒弱毒疫苗。本专利技术中，在步骤(1)中扩增牛病毒性腹泻病毒的Erns基因编码区的片段时，使用下述两条特异性引物通过RT-PCR扩增cDNA片段：上游引物：5＇-GAGAACATAACACAATGGAACCTACAAGATAATGGGA；和下游引物：5＇-TGCATATGCCCCAAACCATGTCTTACTCT。本专利技术中，所述步骤(2)是将CSFV CORE蛋白C端和E1蛋白N端20bp碱基引入BVDV Erns片段中，并使用下述两条特异性引物扩增携带有该同源片段的序列：上游引物：5＇-TGTACCAACCAGTTGAAGCCGAGAACATAACACAATGGAACCTACAAGATAATGGGA；和下游引物：5＇-ACATTACAGTAAGGCGATAGTGCATATGCCCCAAACCATGTCTTACTCT。本专利技术中，所述步骤(3)是使用下述两条特异性引物进行扩增的：上游引物：5＇-CTATCGCCTTACTGTAATGTAACAAGCAAGATA；和下游引物：5＇-GGCTTCAACTGGTTGGTACAACATAATTG。本专利技术中，所述步骤(5)中将含有猪瘟病毒疫苗C株基因组3＇半长的F456片段从重组质粒pB-F456中切下时，使用的是限制性内切酶BamHI和SalI酶。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术的反向遗传操作技术的建立为研究CSFV基因功能和新型疫苗开辟了新的途径。利用反向遗传操作技术将外源标签插入病毒基因组可以用来研究病毒的复制、病毒编码蛋白的功能及抗病毒药物的筛选，使用RNA聚合酶Ⅱ系统已经能够高效和稳定地拯救猪瘟病毒感染性cDNA克隆。研究实例中，将猪瘟病毒C株Erns基因替换为BVDV基因型1b的Erns基因并拯救获得具有感染性的重组病毒，命名为RecC-B-Erns，为开发分子标记猪瘟弱毒疫苗奠定了基础。2、本专利技术构建的嵌合cDNA pA-B-Erns-FL，能够快速收获到具有感染性的子代病毒粒子；拯救的重组病毒保留了C株诱导兔体产生定型热反应以及在兔体内复制等特性，通过对重组病毒第5、15和20代Erns测序发现嵌合基因未发生突变或者丢失现象，说明其遗传稳定性较好；本专利技术还通过改变疫苗C株主要宿主免疫性抗原Erns的抗原性，诱导产生的血清具有潜在的鉴别诊断价值。附图说明图1为基于猪瘟病毒C株为骨架嵌合BVDV Erns基因cDNA全长感染性克隆构建示意图。图2为基因扩增及酶切鉴定图，M为Wide Range DNA Marker(500-15,000)；其中A泳道1为反向PCR扩增的线性化pA-F123，泳道2为BVDV-Erns基因；B泳道1为BamHⅠ和SalⅠ酶切的质粒pA-B-Erns-F123，泳道2为相同酶切的含有猪瘟病毒疫苗C株基因组3’半长的重组质粒pB-F456；C泳道1为嵌合完成的重组质粒pA-B-Erns-FL，泳道2为BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定结果。图3为体外转录RNA电转PK细胞系后，间接免疫荧光(IFA)检测病毒蛋白表达情况；利用抗C-Strain E2的特异性单克隆抗体6B8检测重组病毒连续传代不同代次病毒蛋白的表达情况，A、B、C分别为第1、5、10代重组病毒，D为第10代病毒上清感染ST细胞后，病毒蛋白的表达情况。图4为重组病毒在ST细本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分子标记猪瘟病毒弱毒疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)扩增牛病毒性腹泻病毒中Erns基因编码区的片段；(2)利用步骤(1)的序列扩增带有20bp猪瘟病毒疫苗C株同源区序列的片段；(3)以重组质粒pA‑F123为模板，反向融合PCR获得缺失猪瘟病毒疫苗C株Erns的基因组5＇半长；(4)利用一步定向克隆将步骤(1)和(2)所获得的片段连接到步骤(3)所得质粒，获得携带有BVDV Erns的C株基因组5＇半长的重组pA‑B‑Erns‑F123质粒；(5)将含有猪瘟病毒疫苗C株基因组3＇半长的F456片段从重组质粒pB‑F456中切下，克隆于相同酶作用的步骤(4)所得质粒中，获得重组质粒pA‑B‑Erns‑FL；(6)将步骤(5)中获得的重组全长感染性克隆质粒体外转录为RNA，电转至宿主细胞，收获具有感染性的子代病毒粒子并命名为RecC‑B‑Erns，该子代病毒粒子即为分子标记猪瘟病毒弱毒疫苗。
【技术特征摘要】
1.一种分子标记猪瘟病毒弱毒疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)扩增牛病毒性腹泻病毒中Erns基因编码区的片段；(2)利用步骤(1)的序列扩增带有20bp猪瘟病毒疫苗C株同源区序列的片段；(3)以重组质粒pA-F123为模板，反向融合PCR获得缺失猪瘟病毒疫苗C株Erns的基因组5＇半长；(4)利用一步定向克隆将步骤(1)和(2)所获得的片段连接到步骤(3)所得质粒，获得携带有BVDV Erns的C株基因组5＇半长的重组pA-B-Erns-F123质粒；(5)将含有猪瘟病毒疫苗C株基因组3＇半长的F456片段从重组质粒pB-F456中切下，克隆于相同酶作用的步骤(4)所得质粒中，获得重组质粒pA-B-Erns-FL；(6)将步骤(5)中获得的重组全长感染性克隆质粒体外转录为RNA，电转至宿主细胞，收获具有感染性的子代病毒粒子并命名为RecC-B-Erns，该子代病毒粒子即为分子标记猪瘟病毒弱毒疫苗。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中扩增牛病毒性腹泻病毒的Erns基因编码区的片段时，使用下述两条特异性引物通过RT-PCR扩增cDNA片段：上游引物：5＇-GAGAACATA...
【专利技术属性】
技术研发人员：方维焕，廖迅，李肖梁，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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