本发明专利技术涉及一种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法，属于生物检测技术领域。该方法完全采用免培养的分子微生物生态学的方法，不需要分离菌株，并可对在原位的状态下的人体肠道中蛋白质降解菌进行标定和追踪。本发明专利技术以肠道蛋白质降解菌为标靶，作为人体长期的健康干预的定向指标，为定义和诊断人类肠道微生物功能菌群的稳定性提供数据支持。同时，探测和标定肠道蛋白质降解菌，可发现人个体之间的生理性差异对宿主能量代谢响应的关系。本发明专利技术方法和以前的纯培养方法比较，特点是快速，成本较低，操作简便，操作人员不需要特殊的培训，对检测的地点无特殊的要求，实验结果准确，能迅速提供给诊断人员相关的数据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法。
技术介绍
最新的研究表明，人类肠道中寄生着种类众多的大量细菌，肠道是人类的另一个“器官”，肠道中微生物的组成和代谢与人类健康，如肥胖和糖尿病（II型）密切相关。研究复杂的人类肠道微生物群落的组成与功能及它们如何影响宿主的能量代谢、宿主对微生物群落变化的响应机制是一个新兴前沿的研究领域。肠道菌群是人体的一个基本组成部分，对宿主的营养、健康和疾病存在多方面的影响。所有研究表明，肠道微生物的组成、丰度和功能，对宿主包括免疫系统的调控、营养供给及对抗病原菌的侵入具有重要的调节功能。例如人体的肠道菌群的组成和代谢能力，对于短链脂肪酸（SCFAs）对肠上皮细胞提供能量的提取量的营养价值有显著的影响。但是，这种互惠互利的微生物关系由于遗传或环境因素的干扰会导致稳态击穿和疾病。作为独立的个体，基于饮食习惯、身体状况和基因等方面的原因，每个人的肠道微生物群落的组成各不相同。最近Nature上发表的一篇热门文章根据人体肠道微生物的群落结构将人群分为了三大类型，每一种类型各以一种占优势地位的肠道微生物类群（属水平）为特征：拟杆菌属(Bacteroides)，普雷沃菌属(Prevotella)和瘤胃球菌属(Ruminococcus)。这种像血型一样的简洁分类将在个体医疗和疾病诊断方面具有重大意义。虽然这种分型还有很多不确定性，但是越来越多的研究表明，肠道中微生物的组成和代谢与人类健康密切相关，人体肠道微生物通过影响它们寄主的信号通路可能引发癌症、代谢综合征、甲状腺病变等疾病，特别是对炎症、肥胖、糖尿病（II型）起了关键作用。肠道微生物群落降解食物中人体不能消化的有机物（蛋白质、淀粉和脂肪），以给人体提供附加的能量，从而影响了人体的能量平衡。糖尿病患者和非糖尿病对照人群肠道微生物群落的组成和功能不同，可能是导致糖尿病的病因之一。对于为了长期的健康干预而用这些多样的微生物作为标靶而言，定义和诊断人类肠道微生物功能菌群的稳定性是至关重要的。现有大部分用来分析在我们肠道微生物中的功能菌群都是采用基于纯培养的方法，这使得他们能够对这些细菌群落随着时间的推移而呈现的稳定性有所了解。例如Jeremiah J. Faith及其同事研发出了一种测序方法来准确追踪这些菌株。他们用这种被称作LEA-seq的方法对37人的粪便中的微生物群落进行了采样，他们发现那些吃特别饮食而减肥的人的微生物株发生了改变，表明肠道微生物群的改变可作为宿主健康及功能的标志物。然而，目前所有的研究手段和方法都是在纯培养的基础上分离菌株，再进一步对具有特殊功能的菌株采用分子微生物生态学的方法进行研究。但是对在原位（in situ）状态下（不需要通过纯培养分离菌株），肠道蛋白质降解菌群在肠道营养物转化过程中的作用及其机理却了解很少，特别是标定特殊的肠道蛋白质降解菌群的方法还未开发出来。肠道微生物群落的基本功能是参与人体的营养物转化，肠道中以短链脂肪酸产生为中心的碳水化合物代谢是肠道微生物生态系统能量代谢的主要途径，其中蛋白质的代谢在人体营养物转化和能量代谢过程中起着重要作用，肠道微生物中的蛋白质降解菌群是最重要功能菌群之一，这是因为蛋白质降解是蛋白质代谢过程中的限制步骤。最近的自然杂志上发表了耶鲁大学科学家的研究成果表明，一类研究中蛋白质（称为inflammasomes，负责开启免疫系统的炎症反应，并且起到肠道细菌的传感器和调控者的作用）导致的肠道微生物群落失调，可增加肠道疾病如结肠炎，而肠道环境的改变最终会导致肥胖和肝脏疾病。由于缺少系统的有关参与肠道蛋白质代谢的微生物菌群的原位信息，对肠道微生物在人体蛋白质代谢过程中的作用的了解主要通过纯培养研究，但是，人类肠道微生物群落中只有少数（<20%）被纯培养，而且通过纯培养研究得到的微生物生理生化信息不一定能反映微生物在复杂的生态系统原位的作用和功能，所以人体肠道大部分功能菌群处于未知的状态。采用免培养的分子微生物生态学方法和手段（BODIPY BSA 染色）来标定和追踪原位状态下人体肠道蛋白质降解菌群，不仅对于定义和诊断人类肠道微生物功能菌群的稳定性具有重要的意义，而且为进一步了解肠道蛋白质降解菌群在人体营养物代谢中的利用及转化中的作用和功能，获取原位肠道蛋白质降解菌群的组成和结构的原位信息，了解蛋白质降解菌群与人体之间在肠道营养物的利用和转化中的生态学关系，为进一步探索肠道蛋白质降解菌群在人体代谢疾病发生中的作用机理奠定基础。研究复杂生态系统中微生物菌群的功能一直是微生物生态学者面临的挑战，而其中的难点在于开发和使用能客观反应微生物菌群在生态系统中原位功能的分子微生物生态学方法(Head et al.， 1998) 。迄今为止我们还未见用原位分子微生物生态学方法研究人体肠道微生物群落（例如：蛋白质降解菌群在营养物的利用和转化中的作用的报道，本专利技术将提供代谢疾病（糖尿病患者）肠胃微生物群落中的蛋白质降解菌群的结构及其营养功能的原位信息。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法，该方法完全采用免培养的分子微生物生态学的方法，不需要分离菌株，并可对在原位状态下的人体肠道中蛋白质降解菌进行标定和追踪。本专利技术以肠道蛋白质降解菌为标靶，可以作为人体长期的健康干预的定向指标，为定义和诊断人类肠道微生物功能菌群的稳定性提供数据支持。同时，探测和标定肠道蛋白质降解菌，可发现人个体之间的生理性差异对宿主能量代谢响应的关系。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法，包括如下步骤：步骤（1），在无菌条件下收集粪便中的总细菌：（1.1）样品采集：用无菌药勺随机采集人体新鲜粪便在无菌袋中后，立即保存于37℃的保温箱中，并于20分钟内送到实验室处理；（1.2）稀释样品：取新鲜粪便，加入到pH 7.0-8.0为1×PBS缓冲液，混匀；所述的新鲜粪便与1×PBS缓冲液的质量体积比W/V=（0.95-1.05）：3.5；（1.3）匀浆过滤：将步骤（1.2）混匀的液体转入到Bio-Rad匀浆袋中，然后置于Bio-Rad匀浆器中匀浆，匀浆后，将匀浆袋中的液体通过匀浆袋侧边的过滤格过滤，取滤液；（1.4）滤液离心：将步骤（1.3）的滤液置于离心管中，离心，去除上清液；（1.5）收集细菌细胞：将步骤（1.4）得到的去除上清液的物质重新悬浮于pH为7.0-8.0的1×PBS缓冲液中，得到细胞悬浮液，然后储存于4℃下，待用；本步骤重悬所用的1×PBS缓冲液是步骤（1.2）所用的1×PBS缓冲液体积的13-15%；步骤（2），蛋白质降解细菌的标定和示踪：（2.1）细胞悬浮液离心：取400μL-1000μL的步骤（1.5）制得的细胞悬浮液，离心，去除上清液；（2.2）染色：向加入步骤（1.4）得到的去除上清液的物质中依次加入浓度为10-100mM、pH为7.8-8.0的1×Tris-HCl缓冲液和BODIPY标记的绿色荧光小牛血清白蛋白染液，得到混合液体，之后立即将混合液体转入到宽底血清瓶中，以保证混合液体与绿色荧光小牛血清白蛋白染液充分混合，随后向混合液体中加入叠氮化钠本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），在无菌条件下收集粪便中的总细菌：（1.1）样品采集：用无菌药勺随机采集人体新鲜粪便在无菌袋中后，立即保存于37℃的保温箱中，并于20分钟内送到实验室处理；（1.2）稀释样品：取新鲜粪便，加入到pH 7.0‑8.0为1×PBS缓冲液，混匀；所述的新鲜粪便与1×PBS缓冲液的质量体积比W/V=（0.95‑1.05）：3.5；（1.3）匀浆过滤：将步骤（1.2）混匀的液体转入到Bio‑Rad匀浆袋中，然后置于Bio‑Rad匀浆器中匀浆，匀浆后，将匀浆袋中的液体通过匀浆袋侧边的过滤格过滤，取滤液；（1.4）滤液离心：将步骤（1.3）的滤液置于离心管中，离心，去除上清液；（1.5）收集细菌细胞：将步骤（1.4）得到的去除上清液的物质重新悬浮于pH为7.0‑8.0的1×PBS缓冲液中，得到细胞悬浮液，然后储存于4℃下，待用；本步骤重悬所用的1×PBS缓冲液是步骤（1.2）所用的1×PBS缓冲液体积的13‑15%；步骤（2），蛋白质降解细菌的标定和示踪：（2.1）细胞悬浮液离心：取400μL‑1000μL的步骤（1.5）制得的细胞悬浮液，离心，去除上清液；（2.2）染色：向加入步骤（1.4）得到的去除上清液的物质中依次加入浓度为10‑100mM、pH为7.8‑8.0的1×Tris‑HCl缓冲液和BODIPY标记的绿色荧光小牛血清白蛋白染液，得到混合液体，之后立即将混合液体转入到宽底血清瓶中，以保证混合液体与绿色荧光小牛血清白蛋白染液充分混合，随后向混合液体中加入叠氮化钠至最终浓度为3 mM，接着加入氟乙酸钠至最终浓度为2mM，再加入碘代乙酰胺钠至最终浓度为4mM，盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光；其中，所述的1×Tris‑HCl缓冲液的体积与步骤（2.1）所取的细胞悬浮液体积相同；所用的BODIPY标记的绿色荧光小牛血清白蛋白染液的体积是1×Tris‑HCl缓冲液体积的一半；（2.3）培养：将步骤（2.2）得到的铝箔包严避光的血清瓶固定在旋转摇床上，于25‑35℃下，摇动30‑60分钟，速度保持在220–280 R.P.M；（2.4）观察样品的预处理：于暗室中，吸取10‑20μL步骤（2.3）培养得到的液体，均匀涂布于带有明胶涂层的载玻片上，并在黑暗的环境中风干10‑20分钟；（2.5）观察：将步骤（2.4）干燥好的载玻片置于荧光显微镜物镜台上100×的物镜下，通过绿色荧光激发块观察，显示绿色荧光的即为蛋白质降解细菌。...
【技术特征摘要】
1.一种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），在无菌条件下收集粪便中的总细菌：（1.1）样品采集：用无菌药勺随机采集人体新鲜粪便在无菌袋中后，立即保存于37℃的保温箱中，并于20分钟内送到实验室处理；（1.2）稀释样品：取新鲜粪便，加入到pH 7.0-8.0为1×PBS缓冲液，混匀；所述的新鲜粪便与1×PBS缓冲液的质量体积比W/V=（0.95-1.05）：3.5；（1.3）匀浆过滤：将步骤（1.2）混匀的液体转入到Bio-Rad匀浆袋中，然后置于Bio-Rad匀浆器中匀浆，匀浆后，将匀浆袋中的液体通过匀浆袋侧边的过滤格过滤，取滤液；（1.4）滤液离心：将步骤（1.3）的滤液置于离心管中，离心，去除上清液；（1.5）收集细菌细胞：将步骤（1.4）得到的去除上清液的物质重新悬浮于pH为7.0-8.0的1×PBS缓冲液中，得到细胞悬浮液，然后储存于4℃下，待用；本步骤重悬所用的1×PBS缓冲液是步骤（1.2）所用的1×PBS缓冲液体积的13-15%；步骤（2），蛋白质降解细菌的标定和示踪：（2.1）细胞悬浮液离心：取400μL-1000μL的步骤（1.5）制得的细胞悬浮液，离心，去除上清液；（2.2）染色：向加入步骤（1.4）得到的去除上清液的物质中依次加入浓度为10-100mM、pH为7.8-8.0的1×Tris-HCl缓冲液和BODIPY标记的绿色荧光小牛血清白蛋白染液，得到混合液体，之后立即将混合液体转入到宽底血清瓶中，以保证混合液体与绿色荧...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏云，孔云虹，黄鹤平，王定康，董宝财，
申请(专利权)人：夏云，
类型：发明
国别省市：云南;53
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。