一种抗体修饰纳米微球电泳流动型ELISA的方法，属于生物材料领域。第一抗体吸附在多孔膜表面，再进行封闭剂蛋白吸附；抗原‑第一抗体反应；电泳驱动抗体修饰纳米微球，进行第二抗体‑抗原反应，对酶标第二抗体进行显色定量：电泳驱动第二抗体‑抗原反应后，将多孔膜清洗，所得多孔膜基片放入第二抗体标识酶的底物溶液中，进行显色；通过检测吸光度，进行抗原定量分析。采用正电性PDDA/PSS修饰醋酸纤维素膜PEMs‑CA，羧基聚苯乙烯纳米微球为酶标第二抗体修饰的载体。PEMs修饰降低了非特异性吸附，抗体修饰纳米微球起到信号放大的作用，电泳驱动力使第二抗体短时间内局部浓缩到抗原周围，实现了快速灵敏的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物材料
，特别涉及抗体修饰纳米微球(NP-Ab)的制备，及电泳驱动NP-Ab流动检测的酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法。
技术介绍
酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)，酶(一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记在抗原或者抗体上，由于抗原和抗体的特异性反应和酶催化底物作用结合，通过其颜色变化检测和定量少量蛋白质的试验方法，其检测限(LOD)为0.1ng到1μg/mL，广泛应用于食品、工业、环境监测、和临床医学等诸多领域。由于近年来越来越多蛋白质标志物的出现，对疾病检测的要求也越来越高。但是ELISA在常规的聚苯乙烯基板(polystyrene：PS)基板上的静态温育反应存在以下几个问题：(1)在PS上的第一抗体容易变性，并且与抗原反应的部位不容易裸露在基片表面；(2)封闭效果不佳，导致抗原及第二抗体的非特异性吸附，影响了ELISA系统的灵敏度；(3)在抗原抗体反应过程中，抗原需要长时间的自由扩散，长时间的温育反应成为限速步骤，导致缓慢的结合速度，影响了分析的灵敏度和动态量程。虽然有很多通过纳米材料制备来提高ELISA系统灵敏度的研究，但其操作复杂及成本过高，导致难以实际应用。另外，微细加工芯片牌组器、微阵列芯片、微流体技术，却由于其表面修饰技术的欠缺、操作的复杂性等弊端不能广泛的应用于高灵敏度的临床检测。针对以上ELISA系统的检测弊端，因此，寻找一种可以“快速-灵敏-简便”检测ELISA系统显得尤为重要。将抗体修饰纳米微球与电泳技术有机融合在ELISA系统中，解决常规ELISA体系非特异性吸附高、反应效率低、混合样品检测困难等问题，具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决ELISA系统中样品检测低效率问题并进一步解决低灵敏度的问题，而提供一种聚电解质多层膜基片电泳流动型ELISA方法，尤其提供一种NP-Ab电泳流动型ELISA方法，以解决
技术介绍
中存在的问题。本专利技术所提供一种NP-Ab电泳流动型ELISA方法中，表面羧基化纳米微球修饰酶标识抗体，在抗原抗体特异性反应中起到信号放大的作用，大大提高了检测灵敏度。其次电泳技术作为ELISA体系中NP-Ab流动检测的驱动方式，大大缩短了检测时间，提高了检测效率。本专利技术所提供的一种NP-Ab电泳流动型ELISA的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将第一抗体吸附到聚电解质修饰的多孔膜基片上；(2)吸附第一抗体的多孔膜基片再进行封闭剂蛋白吸附；(3)抗原-第一抗体反应：将步骤(2)第一抗体和封闭剂蛋白吸附后的多孔膜基片加入到抗原溶液中，进行抗原-第一抗体反应；(4)电泳驱动NP-Ab-抗原反应：将步骤(3)抗原-第一抗体反应后的多孔膜基片固定在电泳装置中，在电泳装置中所述的多孔膜基片一侧注入NP-Ab磷酸盐缓冲液即电泳溶液，插入负电极，多孔膜基片另一侧注入磷酸盐缓冲溶液，插入正电极；正电极和负电极加电压，进行抗原-第二抗体反应；(5)对酶标第二抗体进行显色定量：将步骤(4)电泳驱动NP-Ab-抗原反应后的多孔膜基片放入到第二抗体标识酶的底物溶液中，进行显色；通过检测吸光度，进行抗原定量分析。优选上述步骤(1)多孔膜基片是聚电解质多层膜修饰的醋酸纤维素多孔膜(PEMs-CA)，PEMs-CA是依次利用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和聚苯乙烯硫酸钠交叉层叠修饰的CA多孔膜且修饰的最外层是聚(二烯丙基二甲基氯化铵)，得到正电性的PDDA/PSS修饰CA，即PEMs-CA，优选PEMs-CA中聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和聚苯乙烯硫酸钠交叉层叠修饰7层，通过其表面电荷性提高第一抗体与封闭剂(卵清蛋白ovalbumin:OVA)的吸附量，提高抗原与抗体反应的密度(信号)、抑制抗原和第二抗体的非特异性吸附(噪音)，进而大幅度提高灵敏性(信号与噪音比例)。上述多孔膜基片选取醋酸纤维素(cellulose acetate,CA)多孔膜基片，醋酸纤维素多孔膜的孔径优选450nm；选取PDDA/PSS修饰的醋酸纤维素膜为PEMs-CA作为检测溶液透过基片。进一步优选步骤(4)NP-Ab为：羧基化聚苯乙烯纳米微球(微球直径优选为200nm)，通过化学方法将纳米微球表面的羧基和酶标抗体分子的氨基偶联，进行偶联时酶标抗体分子浓度为15-240μg/mL，微球浓度为1-5mg/mL；BγG作为模型蛋白优化酶标第二抗体及纳米微球偶联浓度条件，优选酶标抗体分子浓度与微球浓度分别为60μg/mL，1mg/mL，得到每个纳米微球表面修饰酶标第二抗体的数量约48个。进一步优选步骤(4)电泳驱动NP-Ab-抗原反应的电泳电压和电泳时间，电泳的电压大小决定NP-Ab的移动速度；电泳时间的长短影响NP-Ab与抗原的结合效率。所以进一步调节电泳的电压与时间，从而进一步提高检测灵敏度。电泳电压与时间优化范围为25-35V和1-5min，进一步优选电泳电压与时间为30v、2min。在此电泳流动型ELISA系统中，NP-Ab浓度可进行调节，通过正交试验对NP-Ab浓度进行最优化，确定NP-Ab的最佳浓度为100μg/mL。利用此浓度检测抗原的定量曲线，得到最低检测限为0.13pM。比传统ELISA检测水平高出254倍，检测速度提高了30倍。本专利技术具有以下有益效果：1)本专利技术所提供的NP-Ab电泳流动型ELISA的方法，创制电泳环境中能够高效抑制ELISA非特异性吸附的PEMs。2)本专利技术所提供的NP-Ab电泳流动型ELISA的方法，创制能够起到信号放大作用的NP-Ab。3)本专利技术所提供的NP-Ab电泳流动型ELISA的方法，创制灵敏、快速、简便的电泳流动型ELISA系统。电泳驱动型有效控制带负电NP-Ab向正极电极方向流动，所以在短时间的流动过程中使NP-Ab局部浓缩到多孔膜(即抗原)近旁，完成灵敏、快速的抗体-抗原反应，与传统ELISA相比，既提高了灵敏度又大幅度缩短了反应时间。附图说明图1本专利技术实施例所用电泳装置示意图。图2 NP-Ab流动型ELISA的检测曲线。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术并不限于以下实施例。如所用溶液的浓度、pH值等可根据需要调节等。本专利技术实施例采用的电泳装置见图1。电泳装置为一平放发的圆桶结构，多孔膜位于中间将圆桶一分为二，多孔膜的一侧为NP-Ab溶液，端面设有溶液进口和电极；另一侧为PB缓冲液，端面设有溶液进口和电极。实施例11.溶液的配置：a)50mM Tris-HCl@0.15M NaCl溶液的配置：将1.15175g Tris-base固体溶于125mL超纯水中，取0.84mL HCl溶于100mL超纯水中得0.1M HCl溶液，待溶解后将HCl溶液滴加入Tris-base溶液中调pH＝7.4为止，定容至250mL，称量2.208g NaCl固体加入Tris-HCl中。b)pH＝7.4浓度为0.15M磷酸盐缓冲液(PB)的配置：称取10.74g Na2HPO4·12H2O固体加入到200mL超纯水中,称取4.68g NaH2PO4·2H2O固体加入到200mL超纯水中，待溶解后将NaH2PO4溶液加入到Na2HPO4溶液中，调pH＝本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗体修饰纳米微球电泳流动型ELISA的方法，其特征在于，(1)将第一抗体吸附到聚电解质修饰的多孔膜基片上；(2)吸附第一抗体的多孔膜基片再进行封闭剂蛋白吸附；(3)抗原‑第一抗体反应：将步骤(2)第一抗体和封闭剂蛋白吸附后的多孔膜基片加入到抗原溶液中，进行抗原‑第一抗体反应；(4)电泳驱动NP‑Ab‑抗原反应：将步骤(3)抗原‑第一抗体反应后的多孔膜基片固定在电泳装置中，在电泳装置中所述的多孔膜基片一侧注入NP‑Ab磷酸盐缓冲液即电泳溶液，插入负电极，多孔膜基片另一侧注入磷酸盐缓冲溶液，插入正电极；正电极和负电极加电压，进行抗原‑第二抗体反应；(5)对酶标第二抗体进行显色定量：将步骤(4)电泳驱动NP‑Ab‑抗原反应后的多孔膜基片放入到第二抗体标识酶的底物溶液中，进行显色；通过检测吸光度，进行抗原定量分析。
【技术特征摘要】
1.一种抗体修饰纳米微球电泳流动型ELISA的方法，其特征在于，(1)将第一抗体吸附到聚电解质修饰的多孔膜基片上；(2)吸附第一抗体的多孔膜基片再进行封闭剂蛋白吸附；(3)抗原-第一抗体反应：将步骤(2)第一抗体和封闭剂蛋白吸附后的多孔膜基片加入到抗原溶液中，进行抗原-第一抗体反应；(4)电泳驱动NP-Ab-抗原反应：将步骤(3)抗原-第一抗体反应后的多孔膜基片固定在电泳装置中，在电泳装置中所述的多孔膜基片一侧注入NP-Ab磷酸盐缓冲液即电泳溶液，插入负电极，多孔膜基片另一侧注入磷酸盐缓冲溶液，插入正电极；正电极和负电极加电压，进行抗原-第二抗体反应；(5)对酶标第二抗体进行显色定量：将步骤(4)电泳驱动NP-Ab-抗原反应后的多孔膜基片放入到第二抗体标识酶的底物溶液中，进行显色；通过检测吸光度，进行抗原定量分析。2.按照权利要求1所述的一种抗体修饰纳米微球电泳流动型ELISA的方法，其特征在于，步骤(1)多孔膜基片是聚电解质多层膜修饰的醋酸纤维素多孔膜PEMs-CA，PEMs-CA是依次利用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和聚苯乙烯硫酸钠交叉层叠修饰的CA多孔膜且修饰的最外层是聚(二烯丙基二甲基氯化铵)，得到正电性的PDDA/PSS修饰CA，即PEMs-CA。3.按照权利要求2所述的一种抗体修饰纳米微球电泳流动型ELISA的方法，其特征在于，PEMs-CA中聚(二烯丙...
【专利技术属性】
技术研发人员：申鹤云，张芳芳，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。