本发明专利技术提供一种KRAS基因突变检测试剂盒，包括：（1）用于扩增样本中KRAS基因Exon2、3和4三个外显子的特异性引物，引物序列分别是SEQ ID Nos：1‑6；（2）用于测序PCR的测序引物，分别用于对KRAS基因Exon2、3和4三个外显子进行测序分析，引物序列分别是SEQ ID Nos：7‑9；（3）3个装有KRAS野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管。本试剂盒可直接利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本通过Sanger测序法检测出样本中KRAS基因主要突变位点型别。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种试剂盒，具体涉及一种肿瘤相关基因KRAS基因突变检测试剂盒。
技术介绍
KRAS基因是ras基因家族中三种癌基因的一种，为表皮生长因子受体(EpidermalGrowth Factor Receptor，EGFR) 信号传导通路的下游基因。KRAS基因位于12号染色体上，编码具有GTP酶活性、分子量为 21kD的蛋白，又称为p21蛋白。在ras基因中，KRAS对人类癌症影响最大，它好像分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。她参与细胞内的信号传递，当KRAS基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。KRAS基因的点突变主要集中在特定的氨基酸密码子(第12、13、61、146密码子)上，占所有突变的90％以上。KRAS基因突变可以导致细胞逃逸凋亡，这种在胰腺癌、大肠癌、 肺癌中的发生率较高。在胰腺癌中，KRAS 基因点突变发生率高达 90％以上；而在大肠癌患者KRAS突变率为30％ -35％；肺癌患者KRAS突变率为10-20％。检测 KRAS 基因突变，对判断这些肿瘤的发生和发展、预后以及了解肿瘤的治疗效果具有一定意义。(1)正常人血检中出现KRAS基因异常， 提示属于肿瘤高危人群； (2)良性肿瘤患者若是检出KRAS基因突变，提示有恶变的可能； (3)大量研究表明，KRAS基因突变阳性，即使病理组织学诊断淋巴结转移阴性，癌症复发的可能性也很高；(4)无KRAS基因突变的肺癌、 结直肠癌等肿瘤患者，经抗EGFR靶向药物治疗疗效明显，因此，通过检测KRAS基因突变状态可以筛选用药人群，实现肿瘤患者的个体化治疗，延长患者生存期。临床上靶向新药爱必妥 (Erbitux，西妥昔单抗) 和帕尼单抗 (Panitumumab) 仅适用于无突变的KRAS 基因野生型患者，而对 KRAS突变患者无效。《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》明确指出 ： 一是所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态；二是只有KRAS野生型患者才建议接受EGFR抑制剂如西妥昔单抗(Cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)的治疗；《09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出： 当KRAS基因如果发生了突变，则不建议病人使用特罗凯 (Tarceva/ 厄洛替尼 /Erlotinib)进行分子靶向治疗。 KRAS基因检测是目前医生筛选出抗EGFR(表皮生长因子受体) 靶向药物治疗有效的大肠癌患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而达到良好的预后，延长患者生存期。我国目前对于 KRAS基因检测最新的调研数据结果显示，国内近40家检测中心已完成检测近1000例，其中65.9％为野生型。此时如果做了KRAS基因检测，通过个体化的综合治疗方案，在化疗基础上加靶向药物，如爱必妥，有效率可以达到60％左右。因此，大肠癌患者不但要进行 KRAS基因检测，而且越早越好，这样六成左右的 KRAS 野生型患者就有希望抓住最佳的治疗时期，获得良好的治疗效果。KRAS基因突变的检测主要有Sanger测序法、ARMS、FISH等。其中FISH技术主要适用于拷贝数变异的检测，同时由于操作过程繁琐，该方法以逐渐显现其局限性；ARMS技术是目前国内应用最为广泛的技术，但只能检测已知的位点，且要将样本分成多个管进行实验才能实现分型，对样本量要求高；而Sanger测序法是DNA序列分析的经典方法，最直接的、可检测已知和未知突变的一种方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准，其主要优点是测序长度较长，可发现新的变异位点，包括一些新的少见的突变形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失。所以探索一种Sanger测序法检测KRAS基因的技术具有重要的临床意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述问题，提供一种KRAS基因突变检测试剂盒，可直接利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本通过Sanger测序法检测出样本中KRAS基因主要突变位点型别，检测位点包括KRAS基因2、3和4三个外显子的主要突变位点，包括但不限于2号外显子上c.35G>A, p.G12D突变位点；3号外显子上c.183A>C, p.Q61H突变位点；4号外显子上c.436G>A, p.A146T突变位点。本专利技术的KRAS基因突变检测试剂盒具体包括：（1）用于扩增样本中KRAS基因Exon2、3和4三个外显子的特异性引物，具体序列如下:（2）用于测序PCR的测序引物，分别用于对KRAS基因Exon2、3和4三个外显子进行测序分析，具体序列如下：外显子名称序列号Reverse 5’-3’2SEQ-K2SEQ ID No.7TCTTCCAAATGAGCTGGCAAGT3SEQ-K3SEQ ID No.8TTGGTAACATCCACCCAGATCACT4SEQ-K4SEQ ID No.9TGAAACTCAAGATCGCATTCATGC（3）3个装有KRAS野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管；其中突变型质粒包括2号外显子上c.35G>A, p.G12D突变位点；3号外显子上c.183A>C, p.Q61H突变位点；4号外显子上c.436G>A, p.A146T突变位点； PCR反应预混液由以下组份组成：组份体积（μl）10 PCR buffer2.525mM MgCl22.525mM dNTPs0.4H2O14.35其中10× PCR buffer中含有500 mM KCl，100 mM Tris-HCl (pH 8.3)，100 mM (NH4)2SO4，和15 mM MgCl2；25mM dNTPs中含有25mM dATPs、25mM dTTPs、25mM dCTPs和25mMdGTPs。本试剂盒主是根据KRAS基因的Exon2、3和4三个外显子的保守序列分别设计KRAS基因三个外显子的特异性引物，分别将Exon2、3和4三个外显子使用PCR的方法进行扩增，纯化回收扩增产物。本专利技术的各种引物长度在20-25个碱基之间，无特殊修饰。反应液预混液采用独特的配方及比例。不同外显子的PCR扩增条件一致，且能在样本浓度较低时检测到目的基因，结果无非特异性扩增。具体操作流程包括：（1）引物设计：利用引物设计软件，如Primer Premier 5，从KRAS基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计KRAS基因Exon2、3和4三个外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA,引物序列分别是SEQ ID NOs：1-6。测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列分别是SEQ IDNOs：7-9。（2）PCR扩增：利用试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA。（3）琼脂糖凝胶电泳及胶回收：将扩增得到的目的基因KRAS的Exon2、3和4三个外显子片段回收用于测序。附图说明以下是附图的说明，以便于理解上述专利技术的目的和具体特征。图1为 KRAS基因的Exon2、3和4三个本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测KRAS基因突变的Exon2、3和4三个外显子的引物，包括特异性引物和测序引物，特异性引物序列分别是SEQ ID Nos：1‑6，测序引物序列分别是SEQ ID Nos：7‑9。
【技术特征摘要】
1.用于检测KRAS基因突变的Exon2、3和4三个外显子的引物，包括特异性引物和测序引物，特异性引物序列分别是SEQ ID Nos：1-6，测序引物序列分别是SEQ ID Nos：7-9。2.KRAS基因突变检测试剂盒，包括：（1）用于扩增样本中KRAS基因Exon2、3和4三个外显子的特异性引物，引物序列分别是SEQ ID Nos：1-6；（2）用于测序PCR的测序引物，分别用于对KRAS基因Exon2、3和4三个外显子进行测序分析，引物序列分别是SEQ ID Nos：7-9；（3）3个装有KRAS野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈俊飞，郑焱，谢龙旭，
申请(专利权)人：广州凯普医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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