血细胞样品的EMT-标志物水平差异用于诊断癌症、特别是结直肠(CRC)和胰腺(PC)癌制造技术

本发明专利技术涉及一种确定对象是否患结直肠癌和胰腺癌或确定结直肠癌的阶段和/或进展的方法。测定血液样品中多个编码参与上皮细胞间质转型的转录因子/基因的mRNA存在与否，其中包括TWIST1、SLUG、ZEB2、ZEB1和CDH1的多个基因具有不同的mRNA水平，由此指示结直肠癌或胰腺癌诊断，和/或结直肠癌的诊断分期，和/或CRC的术后转移性进展。本发明专利技术还涉及使用试剂盒来实现该方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及用于疾病诊断、优选用于癌症诊断的分子标志物领域。本专利技术的目的在于检测和测定生物学样品即肿瘤患者的外周血样品中的参与上皮细胞间质转型的基因的mRNA水平，以确定疾病的存在、其进展和复发的风险。背景循环肿瘤细胞(CTCs)是一种从原发性肿瘤或其转移脱落的、循环于外周血的癌症细胞的异质群。目前，癌症患者的全血中的CTCs的原始数量和相关表型与患者的预后临床相关。CTC库包括具有上皮、间充质和类干特征的细胞。已显示人类(Min Yu等，Science，2013，339，580)和动物的癌症内渗与上皮细胞间质转型(EMT)相关，这是一个由转录因子(TFs；例如但不限于TWIST1、ZEB1、ZEB2、SLUG、SNAIL、PRXX1、等)驱动的过程，并且在转移性小生境(niche)中很可能是可逆的(间充质细胞上皮转型，MET)，并接着发生细胞上皮和/或间充质标志物(例如CDH1和Plastin3)改变。所述的转录因子/基因都参与上皮细胞间质转型(EMT-标志物)。因此，人血液中的EMT-标志物的检测有望提供诊断和预后的线索。Celesti等(Gastroenterology 2013，145，647)显示，与来自对照的样品相比，来自结直肠癌症(CRC)患者血液样品的TWIST1 mRNA水平在统计学上(中位数)明显更高。不巧的是，患者和对照的TWIST1水平分布部分重叠，造成对诊断而言，单独测定TWIST1 mRNA不可靠、不适合。Hung Pham等(Pancreas 2010，39，3，332-339)提出：胰腺癌组织样品中的SLUG mRNA过表达与PDGH的下调相关，导致PGE2产出增加。
但是，该文献没有说单独测定血液样品中的SLUG mRNA对诊断胰腺癌而言是可靠且适宜的。
技术实现思路
通常，FDA批准的方法(即“细胞搜索”(Veridex公司)、“AdnaTest乳腺癌筛选”以及“Adnatest乳腺癌检测”(AdnaGen AG公司)、“BioceptOnco CEE”(生物概念实验室(Biocept Laboratories))通过检测CTCs等表达的上皮抗原表达。因此这些测试的诊断和预后价值有限。本文作者展示了特异性针对肿瘤患者的循环细胞中的上皮细胞间质转型(EMT)基因的定量RT-PCR试验。与现有技术所报告的不同，在提取mRNA之前，不需要先进行循环细胞群的分离。该方式能够检测循环EMT-TF的转录水平升高，不论是何抗原或表型的细胞特征。本文作者发现CRC患者的血细胞中有高水平的TWIST1、SLUG和低水平的ZEB1 mRNA，而胰腺癌(PC)患者的血细胞中则有高水平的SLUG、TWIST 1和ZEB2 mRNA患者，据此可进行更可靠且确信的诊断。因此，本专利技术的目的之一是一种确定对象是否患癌症的方法，该方法包括检测来自所述对象的血细胞样品中是否存在一组mRNA、其中至少包括SLUG和TWIST1 mRNA，其中a)TWIST1和SLUG基因的mRNA水平高于对照样品而ZEB2基因的mRNA水平不高于对照样品指示结直肠癌，b)TWIST1、SLUG、和ZEB2基因的mRNA水平均高于对照样品指示胰腺癌，c)至少SLUG mRNA水平高于第一SLUG界限值(cut-off)指示结直肠或胰腺癌，d)在SLUG mRNA水平不高于第一SLUG界限值的对象中，TWIST1mRNA水平高于TWIST1界限值指示结直肠癌，条件是所述对象还显示SLUG mRNA高于于第二SLUG界限值，所述第二SLUG界限值低于第一SLUG界限值，且/或CDH1 mRNA水平低于CDH1界限值，e)在SLUG mRNA水平不升高的对象中，TWIST1 mRNA水平高于
TWIST1界限值指示胰腺癌，条件是所述对象还显示ZEB2 mRNA水平升高。在上述方法中，对照样品是来自正常对象或非PC、非CRC癌症患者的样品。优选地，在根据本专利技术的方法中，SLUG和TWIST1 mRNA水平均高于各自界限值指示结直肠或胰腺癌。优选地，在根据本专利技术的方法中，在SLUG mRNA水平高于第一SLUG界限值而TWIST1 mRNA水平没有高于TWIST1界限值的对象中，ZEB2mRNA水平高于ZEB2界限值指示胰腺癌。优选地，在根据本专利技术的方法中，在SLUG mRNA水平高于第一SLUG界限值而TWIST1 mRNA水平没有高于TWIST1界限值的对象中，CDH1mRNA水平低于CDH1界限值指示结直肠癌。优选地，在根据本专利技术的方法中，各界限值如下：-结直肠癌的第一SLUG界限值7.93018E-9，-结直肠癌的第二SLUG界限值1.84E-10，-胰腺癌的第一SLUG界限值3.27E-9，-结直肠癌的TWIST1界限值1.00725E-8，-胰腺癌的TWIST1界限值1.35E-8，-CDH1界限值：7.29E-8，-胰腺癌的ZEB2界限值：7.19E-6。本专利技术的另一个目的是一种在根据上述方法得到阳性结果的对象中区分结直肠癌和胰腺癌的方法，该方法包括分析来自所述对象的血细胞样品，其中，相对于来自结直肠癌患者的合适对照，ZEB1和/或ZEB2和/或CDH1 mRNAs中任一升高指示胰腺癌。优选地，在上述方法中，ZEB2 mRNA水平高于界限值4.08E-5且/或CDH1 mRNA高于界限值1.022E-7。本专利技术的另一个目的是一种确定患病对象结直肠癌阶段的方法，该方法包括分析来自所述对象的血细胞样品，其中：a)ZEB1 mRNA水平高于来自结直肠癌患者的对照样品指示次晚期结直肠癌且/或b)CDH1 mRNA水平低于来自结直肠癌患者的对照样品指示诊出转移性(即IV期)疾病，且/或c)TWIST1 mRNA水平高于来自结直肠癌患者的对照样品指示异时性转移发展。在上述用于确定结直肠癌阶段的方法中，在步骤a)中，对照样品可以是来自结直肠癌阶段已知的对象的样品；在步骤b)中，对照样品可以是来自患有结直肠癌但没有转移病灶的对象的样品；在步骤c)中，对照样品可以是来自患有结直肠癌但没有发生转移的对象的样品。根据本专利技术的方法中，所述血细胞样品优选富集了循环肿瘤细胞(CTC)的细胞样品。优选地，所述富集了循环肿瘤细胞(CTC)的细胞样品是外周血单核细胞(PBMC)样品。在根据本专利技术的方法中，mRNA水平优选通过RT-PCR测定。本领域技术人员所知的检测血液样品中特定mRNA的各种其他方法也在本专利技术的范围内。示例性的例子有：PCR扩增方法(QX200TM Droplet DigitalTMPCR系统、TaqMan探针)、其他扩增方法；以及单细胞基因表达分析(miRGE-)。本专利技术的方法能够检测人类或动物血液样品中的EMT转录产物；例如，该方法可包括以下步骤：a)外周血单核细胞(PBMC)的菲科尔(Ficoll)密度梯度分离，b)使用RT-PCR进行的EMT基因表达水平检测，c)患者和正常对照的EMT基因水平的比较，d)如果检测所得的EMT基因水平统计学上显著地不同于正常水平(高于或低于视所选基因而预先确定的界限值)，则将患者诊断为特定肿瘤。本专利技术的另一个目的是用定量RT-PCR试剂盒来实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种确定对象是否患癌症的方法，该方法包括分析来自所述对象的血细胞样品中一组mRNA存在与否，所述mRNA组至少包括SLUG和TWIST1mRNA，其中a)TWIST1和SLUG基因的mRNA水平高于对照样品而ZEB2基因的mRNA水平不高于对照样品指示结直肠癌，a)TWIST1、SLUG和ZEB2基因的mRNA水平均高于对照样品指示胰腺癌，c)至少SLUG mRNA水平高于第一SLUG界限值指示结直肠癌或胰腺癌，d)SLUG mRNA水平不高于所述第一SLUG界限值的对象中，TWIST1mRNA水高于TWIST1界限值指示结直肠癌，条件是所述对象还显示SLUG mRNA高于第二SLUG界限值的，所述第二SLUG界限值低于所述第一SLUG界限值，且/或CDH1mRNA水平低于CDH1界限值，e)在SLUG mRNA水平不升高的对象中，TWIST1mRNA水平高于TWIST1界限值指示胰腺癌，条件是所述对象还显示ZEB2mRNA水平升高。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.16 EP 13197367.91.一种确定对象是否患癌症的方法，该方法包括分析来自所述对象的血细胞样品中一组mRNA存在与否，所述mRNA组至少包括SLUG和TWIST1mRNA，其中a)TWIST1和SLUG基因的mRNA水平高于对照样品而ZEB2基因的mRNA水平不高于对照样品指示结直肠癌，a)TWIST1、SLUG和ZEB2基因的mRNA水平均高于对照样品指示胰腺癌，c)至少SLUG mRNA水平高于第一SLUG界限值指示结直肠癌或胰腺癌，d)SLUG mRNA水平不高于所述第一SLUG界限值的对象中，TWIST1mRNA水高于TWIST1界限值指示结直肠癌，条件是所述对象还显示SLUG mRNA高于第二SLUG界限值的，所述第二SLUG界限值低于所述第一SLUG界限值，且/或CDH1mRNA水平低于CDH1界限值，e)在SLUG mRNA水平不升高的对象中，TWIST1mRNA水平高于TWIST1界限值指示胰腺癌，条件是所述对象还显示ZEB2mRNA水平升高。2.如权利要求1所述的方法，其中，SLUG和TWIST1mRNA水平都高于各自界限值指示结直肠癌或胰腺癌。3.如权利要求1所述的方法，其中，在SLUG mRNA水平高于第一SLUG界限值且TWIST1mRNA水平不高于TWIST1界限值的对象中，ZEB2mRNA水平高于ZEB2界限值指示胰腺癌。4.如上述权利要求中任一项所述的方法，各界限值如下：-结直肠癌的第一SLUG界限值7.93018E-9，-结直肠癌的第二SLUG界限值1.84E-10，-胰腺癌的第一SLUG界限值3.27E-9，-结直肠癌的TWIST1界限值1.00725E-8，-胰腺癌的TWIST1界限值1.35E-8，-CDH1界限值：7.29E-8，-胰腺癌的ZEB2界限值：7.19E-6。5.一种在如上述权利要求中任一项所述方法得到阳性结果的对象中区分结直肠癌和胰腺癌的方法，该方法包括测试来自所述对象的血细胞样品，其中相对于来
\t自结直肠癌患者的合适对照，ZEB1和/或ZEB2和/或CDH1mRNAs中任一升高指示胰腺癌。6.如权利要求5所述的方法，其中，ZEB2mRNA水平高于界限值4.08E-5且/或CDH1mRNA高于界限值1.022E-7。7.一种确定患病对象结直肠癌阶段的方法，该方法包括测试来自所述对象的血细胞样品，其中：a)ZEB1mRNA水平高于来自结直肠癌患者的对照样品指示次晚期结直肠癌且/或b)CDH1mRNA水平低于来自结直肠癌患者的对照样品指示诊出...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·拉吉，G·塞莱斯蒂，
申请(专利权)人：博爱米拉索勒股份公司，
类型：发明
国别省市：意大利;IT