本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于ABCB1基因分型的ARMS‑qPCR检测试剂盒，本发明专利技术还涉及一种基于本试剂盒的ABCB1基因分型ARMS‑qPCR检测方法。其中，本试剂盒包括qPCR反应体系，所述qPCR反应体系包括qPCR混合反应液、参照引物、ARMS引物和阳极对照样品；所述qPCR混合反应液包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl2、Tag酶、PCR上下游引物和TaqMan探针；所述qPCR反应体系中，各组分的终浓度分别为：PCR缓冲液为1X；dNTP为0.1～1.5mM；MgCl2为0.5～5mM；Tag酶为0.05～0.1U/μl；PCR下游引物为0.1～1μM；TaqMan探针为0.1～1μM；参照引物为0.5μM；ARMS引物为0.5μM；阳性对照样品为1～10ng/μl。本试剂盒能快速、灵敏、准确的检测ABCB1不同基因型，可以检测不同来源的基因组DNA，如血液、口腔黏膜细胞、头发等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于ABCB1基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒，本专利技术还涉及一种ABCB1基因分型ARMS-qPCR检测方法。
技术介绍
ABCB1基因位于人类基因组第7号染色体(7q21)，编码一个长1280个氨基酸的蛋白。它具有12个跨膜的结构域，在其细胞内有ATP的结合位点。这个基因是一个转运蛋白，可以运转一些药物到细胞内，起着非常重要的生理功能。ABCB1蛋白在血脑屏障中高表达，将许多药物以及神经毒素排出以保护大脑。现有研究表明，ABCB1不同的基因型与抑郁症的潜在发病紧密相关(Fuji etal.2012)。抑郁症又称忧郁症，是以情绪低落为主要特征的一类心理疾病，其临床表现轻型病人外表如常，内心有痛苦体验。稍重的人可表现为情绪低落、愁眉苦脸、唉声叹气、自卑等，有些患者常常伴有神经官能症症状，如：注意力不集中、记忆力减退、反应迟缓和失眠多梦等症状。重型抑郁症患者会出现悲观厌世、绝望、自责自罪、幻觉妄想、食欲不振、体重锐减、功能减退、并伴有严重的自杀企图，甚至有自杀行为，因此对人类健康构成严重威胁。随着现代生活节奏的加快和压力的增大，越来越多的人罹患忧郁症，北京市15岁以上的人群中，抑郁障碍的终生罹患率为6.87％，全国的罹患率在5-10％之间，其中女性的罹患率是男性的两倍。据世界卫生组织预计，到2020年，抑郁症将成为继冠心病后的第二大疾病负担源。科学研究发现ABCB1基因的不同基因型与抑郁症的罹患风险密切相关，T3435纯合基因型与C3435以及C/T3435杂合基因型的人罹患抑郁症的风险有显著地差异(Fuji et al.2012)。因此，ABCB1基因3435位置的不同基因型是预测抑郁症潜在风险的极好生物标志物，检测ABCB1基因3435位置的不同基因型对于提前预防抑郁症，节约医疗资源具有重要的意义。可用于ABCB1基因分型的技术很多，包括如DNA直接测序法、杂交芯片法、焦磷酸测序法以及变性高效液相色谱法等。其中，DNA测序法为基因分型的金标准，该方法存在如下缺点：检测的灵敏度不高，只有大于15％的突变才能检测到；费时，操作复杂，对操作人员要求高；非闭管操作，涉及PCR扩增后的操作，因此易被污染，造成结果的不理想；通量太小，一次最多只能做24个，很难大规模开展。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是针对技术现状提供一种灵敏度高、特异性强的用于ABCB1基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒。本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供一种ABCB1基因分型的ARMS-qPCR检测方法，该检测方法灵敏度高、特异性强，而且操作简单。本专利技术解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种用于ABCB1基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒，包括qPCR反应体系，所述qPCR反应体系包括qPCR混合反应液、参照引物、ARMS引物和阳极对照样品；所述qPCR混合反应液包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl2、Tag酶、PCR下游引物和TaqMan探针；所述qPCR反应体系中，各组分的终浓度分别为：PCR缓冲液为1X；dNTP为0.1～1.5mM；MgCl2为0.5～5mM；Tag酶为0.05～0.1U/μl；PCR下游引物为0.1～1
μM；TaqMan探针为0.1～1μM；参照引物为0.5μM；ARMS引物为0.5μM；阳性对照样品为1～10ng/μl。其中，所述PCR下游引物的序列如ABCB1-R所示；所述TaqMan探针的序列如ABCB1-TaqMan所示；所述参照引物的序列如ABCB1-C所示，能够扩增所有不同ABCB1基因型；所述ARMS引物为两种上游引物中的任意一种，分别对应ABCB1 CC3435、TT3435型基因型，这两种上游引物的序列如ABCB1-F1、ABCB1-F2所示；这两种ARMS引物分别在3’末端与不同的基因型碱基匹配，同时在其3’末端倒数第2、3位增加一个或者两个碱基错配，以增加其特异性；用于特异性扩增的ABCB1 3435位基因型为TT/CC/TC；所述阳极对照样品分别为ABCB1不同基因型碱基置换的质粒基因组DNA。各引物序列列举如下：ABCB1-R：5’-AAACAGGAAGTGTGGCCAGA-3’ABCB1-TaqMan：5’-FAM-CTCTCTTCAAATAAACAGCC-3’ABCB1-C：5’-CCTATGGAGACAACAGCCGG-3’ABCB1-F1：5’-GTGGTGTCACAGGAAGAGGCT-3’ABCB1-F2：5’-GTGGTGTCACAGGAAGAGGCC-3’其中，所述Tag酶为Takara Tag酶或Goldstar Best Tag酶。本专利技术解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：基于上述试剂盒的ABCB1基因分型ARMS-qPCR检测方法，该方法先是针对ABCB1基因设计一对参照引物、TaqMan探针，针对3435位点的不同基因型设计ARMS引物，反应体系中加入qPCR混合反应液，参照引物或者ARMS引物、TaqMan引物和待测模板DNA进行荧光定量PCR的检测，具体包括如下步骤：(1)设计并筛选含有ABCB1基因3435位不同基因型通用的参照引物、TaqMan探针及两种ARMS引物；(2)从细胞体系或血液中提取到基因组DNA作为模板DNA；(3)进行实时荧光定量PCR扩增，每个样本的检测分3管进行，每个管加入相同的qPCR混合反应液，TaqMan探针和模板DNA，每管分别加入参照引物和两种ARMS引物中的一种，进行ABCB1基因3435位基因分型的qPCR检测；(4)结果判读：参照引物管扩增曲线阳性，ABCB1-F1管扩增曲线阳性，ABCB1-F2管扩增曲线阴性或者其与参照引物管的扩增曲线ΔCT＞10，该样本结果判定为3435TT基因型；参照引物管扩增曲线阳性，ABCB1-F1管扩增曲线阳性，ABCB1-F2管扩增曲线阳性，该样本结果判定为3435C/T基因型；参照引物管扩增曲线阳性，ABCB1-F1管扩增曲线阴性或者其与参照引物管的扩增曲线ΔCT＞10，ABCB1-F2管扩增曲线阳性，该样本结果判定为3435CC基因型；参照引物管扩增曲线阴性，提示该样本提取失败，需要重新进行提取。所述步骤(2)中，模板DNA选自人体血液基因组DNA或者口腔黏膜脱落细胞或头发。所述步骤(3)中，进行PCR扩增反应的条件为，95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃延伸1min，46个循环。上述技术方案中所提及的qPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCRDetecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术提供了一种ABCB1基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒，以解决现有基因分型检测技术中费时、程序繁琐以及易污染等问题。本试剂盒可以快速、准确、便宜、高通量给ABCB1基因进行分型，其灵敏度高、特异性强，适用于常见样本比如血液、口腔黏膜以及头发等。本试剂盒能快速、灵敏、准确的检测ABCB1不同基因型，可以检测不同来源的基因组DNA，如血液、口本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于ABCB1基因分型的ARMS‑qPCR检测试剂盒，其特征在于：包括qPCR反应体系，所述qPCR反应体系包括qPCR混合反应液、参照引物、ARMS引物和阳极对照样品；所述qPCR混合反应液包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl2、Tag酶、PCR下游引物和TaqMan探针；所述qPCR反应体系中，各组分的终浓度分别为：PCR缓冲液为1X；dNTP为0.1～1.5mM；MgCl2为0.5～5mM；Tag酶为0.05～0.1U/μl；PCR下游引物为0.1～1μM；TaqMan探针为0.1～1μM；参照引物为0.5μM；ARMS引物为0.5μM；阳性对照样品为1～10ng/μl；所述PCR下游引物的序列如ABCB1‑R所示；所述TaqMan探针的序列如ABCB1‑TaqMan所示；所述参照引物的序列如ABCB1‑C所示，能够扩增所有不同ABCB1基因型；所述ARMS引物为两种上游引物中的任意一种，分别对应ABCB1CC3435、TT3435型基因型，这两种上游引物的序列如ABCB1‑F1、ABCB1‑F2所示；这两种ARMS引物分别在3’末端与不同的基因型碱基匹配，同时在其3’末端倒数第2、3位增加一个或者两个碱基错配，用于特异性扩增的ABCB13435位基因型为TT/CC/TC；所述阳极对照样品分别为ABCB1不同基因型碱基置换的质粒基因组DNA。...
【技术特征摘要】
1.一种用于ABCB1基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒，其特征在于：包括qPCR反应体系，所述qPCR反应体系包括qPCR混合反应液、参照引物、ARMS引物和阳极对照样品；所述qPCR混合反应液包括PCR缓冲液、dNTP、MgCl2、Tag酶、PCR下游引物和TaqMan探针；所述qPCR反应体系中，各组分的终浓度分别为：PCR缓冲液为1X；dNTP为0.1～1.5mM；MgCl2为0.5～5mM；Tag酶为0.05～0.1U/μl；PCR下游引物为0.1～1μM；TaqMan探针为0.1～1μM；参照引物为0.5μM；ARMS引物为0.5μM；阳性对照样品为1～10ng/μl；所述PCR下游引物的序列如ABCB1-R所示；所述TaqMan探针的序列如ABCB1-TaqMan所示；所述参照引物的序列如ABCB1-C所示，能够扩增所有不同ABCB1基因型；所述ARMS引物为两种上游引物中的任意一种，分别对应ABCB1CC3435、TT3435型基因型，这两种上游引物的序列如ABCB1-F1、ABCB1-F2所示；这两种ARMS引物分别在3’末端与不同的基因型碱基匹配，同时在其3’末端倒数第2、3位增加一个或者两个碱基错配，用于特异性扩增的ABCB13435位基因型为TT/CC/TC；所述阳极对照样品分别为ABCB1不同基因型碱基置换的质粒基因组DNA。2.根据权利要求1所述的用于ABCB1基因分型的ARMS-qPCR检测试剂盒，其特征在于：所述Tag酶为Takara Tag酶或Goldstar Bes...
【专利技术属性】
技术研发人员：张道允，巩子英，张恒，罗坚诚，贾宁，
申请(专利权)人：江苏所罗门兄弟医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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