用于检测和测定牡荆素的抗体、方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供包括牡荆素或其衍生物的半抗原，与赋予抗原性的载体物质结合的前述半抗原的免疫原，与标记试剂结合的前述半抗原的偶联物(包被原)，以及抗前述免疫原的抗体，该抗体能与完整的牡荆素中的至少一种结构性抗原决定部位结合。本发明专利技术还提供用于检测或定量样品中牡荆素的方法和试剂盒，以及前述偶联物和前述抗体在检测或定量牡荆素中的用途。本发明专利技术对牡荆素具有特异性，可用于样品中检测牡荆素的存在和测定牡荆素的含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及小分子半抗原的抗体及其制备方法与应用，特别是涉及牡荆素及其衍生物的抗体及其制备方法与应用。
技术介绍
本专利技术涉及用于检测和定量牡荆素的方法和试剂盒，以及其中使用的半抗原、免疫原、偶联物(conjugate)和抗体。其中“检测”是指定性分析物质是否存在。其中“测定”是指对物质进行定量分析。牡荆素，存在于蔷薇科植物山楂的干燥成熟果实。分子式：C21H20O10 分子量：432.3775牡荆素属于黄酮类化合物，熔点256-258℃，溶于DMSO、DMF、氯仿甲醇混合溶剂，不溶于水、石油醚等溶剂。研究表明，牡荆素显示多种生物学活性和药理作用。有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抑菌等药理活性，并能明显的降压、抗感染和抗非特异性的痉挛，有较高的经济价值及药用价值。目前建立了多种牡荆素的定性与定量检测和测定分析方法，如薄层色谱扫描法、HPLC法，HPLC-MS法等。其中最常用的方法是高效液相色谱法。但含牡荆素的生物样品(包括血浆、尿、唾液等)含有大量的影响含量测定的蛋白质及内源性物质；同时还需要浓缩以满足仪器检测灵敏度的要求，处理程序复杂，费时费力；另外由于牡荆素进入体内后，组织中的分布是极其微量的，即使经过富集，进行含量测定仍是极其困难的。最后，对于牡荆素在靶器官和组织中分布，以及细胞和亚细胞定位的研究，需要通过免疫组织化学和westblot等方法，但由于缺乏牡荆素的抗体，阻碍了此方面的研究。因此，有必要开发出一种用于检侧和测定生物样品中牡荆素的方法，对阐明相关药材或复方的作用机理，以及其体内分布和代谢研究，将具有特别的价值。
技术实现思路
本专利技术的半抗原牡荆素可提供确定的结构性抗原决定部位，但是它本身并不具备免疫原性，因此必须要偶联到适宜的赋予抗原性的载体物质上，这样所形成的免疫原才会在注射到宿主动物体内后诱发免疫应答。因此，本专利技术提供一种如下结构的免疫原：其中R是0至6个碳的烷基桥(连接半抗原与载体物质的桥)，优选R＝0，即P1直接与牡荆素氧化后的醛基结合，或R是C1-C6取代或未取代的、直链或支链的、饱和或不饱和的亚烷基，更优选R是C1-C4未取代的、直链的、饱和的亚烷基。P1是赋予抗原性的载体物质。载体物质选自蛋白质、蛋白质片合成的多肽或半合成的多肽。其中蛋白质、蛋白质片段选自白蛋白、血清蛋白、球蛋白、目镜蛋白和脂蛋白，优选为牛血清白蛋白、卵清蛋白、牛丙种球蛋白、甲状腺素结合球蛋白、锁眼形血蓝蛋白(keyhole limpet haemocyanin，KLH)，更优选自锁眼形血蓝蛋白或牛血清蛋白(BSA)。合成多肽或半合成多肽是具有足够数量的可利用氨基的合成聚氨基酸，优选多聚赖氨酸。合成或天然聚合物是带有反应官能基的聚合物材料，特别是能够结合到半抗原产生免疫原的碳水化合物、酵母或多糖。半抗原的制备本专利技术描述了半抗原牡荆素的糖苷结构中的两个邻羟基经过过碘酸钠氧化为醛基从而与载体物质发生的偶联作用，产生免疫原。偶联物成功制备并纯化后分别经质谱(MS)和核磁共振氢谱和碳谱(1HNMR和13CNMR)确证。免疫原的合成本专利技术的半抗原和蛋白质载体的连接可使用本领域己知的任何连接方式。例如过碘酸盐氧化法等。采用过碘酸氧化法制备免疫原时，是将4.8毫克的半抗原牡荆素溶解在4mlDMF中，加入含有5毫克的过碘酸钠溶液1毫升，室温下反应一个半小时，称取BSA各3.6mg分别充分溶于2mLCBS中，准确加入到上述反应体系中，搅拌反应过夜，装入透析袋，用蒸馏水或0.01mol/L的PBS缓冲溶液透析3-5d，分装保存于-20℃的冰箱中。合成免疫原的分析方法 为了确认载体物质上结合有适当的半抗原，在免疫前，使用紫外全波长扫描法或薄层色谱法对其进行初步评估，也可用矩阵辅助紫外激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对每个免疫原进行精确评估。牡荆素免疫原反应物和产物的吸收峰相比(200nm-400nm)，可判断是否偶合，并根据反应物和产物的摩尔吸光系数计算偶联物与半抗原的比例。使用voyager STR生物分光度测量方法研究站激光解析质谱与延迟萃取结合进行MALDI -TOF质谱。将每个要分析的等分试样在0.1％的三氟乙酸水溶液中稀释制成1mg/ml的试样溶液。使用芥子酸基质和牛血清白蛋白作为外标分析等分试样(1uL)。对于优选的载体物质，牛血清白蛋白或KLH而言，优选半抗原与蛋白质的结合比为6-15∶1。第二方面，免疫检测时需要将牡荆素与标记试剂进行偶合。因此，本专利技术提供一种如下结构的偶合物；其中R是0至6个碳的烷基，P2是可检测的标记试剂，标记试剂选自酶、发光物质、放射性物质或它们的混合物，更优选地标记试剂是过氧化物酶。最优选地标记试剂是辣根过氧化物酶(HRP)。发光物质选自生物发光物质、化学发光物质或荧光物质。偶合物的合成本专利技术的半抗原和蛋白质载体的连接可使用本领域己知的任何连接方式。例如过碘酸盐氧化法等。采用过碘酸氧化法制备免疫原时，是将4.8毫克的半抗原牡荆素溶解在4mlDMF中，加入含有5毫克的过碘酸钠溶液1毫升，室温下反应一个半小时，称取BSA各3.6mg分别充分溶于2mLCBS中，搅拌反应过夜，装入透析袋，用蒸馏水或0.01mol/L的PBS缓冲溶液透析3-5d，分装保存于-20℃的冰箱中。另一方面，本专利技术涉及对于本专利技术第一方面的免疫原产生的抗体，这些抗体能够至少与一个牡荆素结构上的表位结合，优选与完整的牡荆素结构表位相结合，该抗体是多克隆的，或是单克隆的，优选为单克隆抗体，且具有对牡荆素的特异性的抗体。免疫检测时要将该抗体固定在支撑底物上。优选地，该方法进一步包括将所述血清抗体固定到支撑底物上，优选固体支持物，最优选聚苯乙烯固体支持物。本专利技术进一步提供一种制备抗体的方法，该方法包含通过重复给予根据本专利技术的牡荆素的免疫原免疫动物，优选脊稚动物，最优选哺乳动物，并收集从免疫动物得到的血清的步骤。另一方面，本专利技术包括在试样中检测或测定牡荆素的方法，该方法包括用本专利技术的偶合物或其混合物和本专利技术的抗体或其混合物接触试样；检测或测定结合的缀合物的数量；并且从标准曲线推断试样中牡荆素的的存在或数量。另一方面，本专利技术还描述了如何将针对这种免疫原产生的抗体用于开发可用来检测和测 定牡荆素的存在的通用分析方法和相应的试剂盒。该试剂盒包括用本专利技术的偶合物或其混合物和本专利技术的抗体或其混合物，同时该试剂盒可以任意地包括应用所述缀合物和所述抗体在试样中检测或测定牡荆素的指导。优选地，试样是溶液，如生物流体。更优选地，试样是血清或尿。在本专利技术的方法和试剂盒中，首选各自不同的交联剂(免疫原的和偶合物的)。另一方面，本专利技术包括使用本专利技术的偶合物或其混合物和本专利技术的抗体或其混合物在试验试样如生物流体中检测或测定牡荆素。为了产生多克隆抗血清，将免疫原与Freund佐剂混合，并且将混合物注射入宿主动物体内，如兔、羊、鼠、天竺鼠或马。进一步注射(加强)并取血清试样评价抗体滴度。达到最佳滴度时，随后将宿主动物放血得到适当体积的特异性的抗血清。要求的抗体纯化水平视计划的应用而定。对于许多目的，根本不需要纯化，但是，在其它情况下，例如抗体固定在固体载体上，纯化步骤能够除去不想要的物质和除去非特异性的结合。本专利技术特异性抗体作为试剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种如下通式的免疫原：其中R是0至6个碳的烷基桥(连接半抗原与载体物质的桥)，P1是赋予抗原性的载体物质。

【技术特征摘要】
1.一种如下通式的免疫原：其中R是0至6个碳的烷基桥(连接半抗原与载体物质的桥)，P1是赋予抗原性的载体物质。2.根据权利要求1的免疫原，R＝0，即P1直接与牡荆素氧化后的醛基结合。3.根据权利要求1的免疫原，R是C1-C6取代或未取代的、直链或支链的、饱和或不饱和的亚烷基。4.根据权利要求1或3的免疫原，R是C1-C4未取代的、直链的、饱和的亚烷基。5.根据权利要求1的免疫原，其中载体物质为蛋白质、蛋白质片段、合成或天然多肽或半合成多肽、合成或天然聚合物。6.根据权利要求1或5的免疫原，其中蛋白质、蛋白质片段选自白蛋白、血清蛋白、球蛋白、和脂蛋白。7.根据权利要求1或5的免疫原，其中蛋白质、蛋白质片段选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、牛丙种球蛋白、甲状腺素结合球蛋白、锁眼形血蓝蛋白(keyhole limpet haemocyanin，KLH)等。8.根据权利要求1或5的免疫原，其中合成或天然多肽或半合成多肽是具有足够数量的可利用氨基的合成聚氨基酸。9.根据权利要求1或5的免疫原，其中合成或天然聚合物选自碳水化合物、酵母或多糖。10.抗如权利要求1至9的免疫原的抗体，其中抗体能与完整的牡荆素中的至少一种结构性抗原决定部位结合。11.如权利要求10的抗体，其中当抗原固定在支持底物上，特别是聚苯乙烯固体支持物时，抗体可以与其特异性...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵琰，屈会化，王庆国，冯盛岚，冯会宾，任雅君，单文超，成金俊，张越，赵妍，胡文婷，
申请(专利权)人：北京中医药大学，
类型：发明
国别省市：北京;11