一种嗜热纤维素酶及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种嗜热纤维素酶及其编码基因和应用。所述嗜热纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术提供了一个新的纤维素酶，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明专利技术的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的纤维素酶。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种嗜热纤维素酶及其编码基因和应用。
技术介绍
植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素及木质素等物质构成。纤维素是一种重要的多糖，它是植物细胞支撑物质的材料，是自然界最丰富的生物质资源，纤维素的结构确定为β-D-葡萄糖单元经β－(1→4)糖苷键连接而成的直链多聚体，结构中没有分支，其能够被纤维素酶降解为葡萄糖。纤维素酶是指能够水解葡萄糖苷键，将纤维素分解成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称。其对纤维素的水解过程主要包括三步：第一步是内切型纤维素酶作用于纤维素内部的无定形区，随即水解β－(1→4)糖苷键将纤维素分子截短，随后外切型纤维素酶，作用于纤维素线状分子末端，水解β－(1→4)糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，最后，葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。纤维素酶已被广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶，具有很大的潜在应用价值。纤维素酶广泛存在于细菌、放线菌、真菌、植物、动物等生物中。不同的微生物产生的纤维素酶，其结构和功能差异较大。嗜热纤维素酶与常温纤维素酶相比具有诸多优势，如催化效率高，底物专一性强，热处理木质纤维素时酶稳定性好，因而对反应体系具有良好的兼容性等。到目前为止，嗜热纤维素酶多来源于细菌，主要来源海栖热孢菌属、热子囊菌Thermoascus aurantiacus)等。然而，高温细菌来源的嗜热纤维素酶表达量低，难以进行工业生产。目前商业化的纤维素酶主要由真菌产生，如木霉、青霉、曲霉等。真菌来源的纤维素酶最适温度多在45到65℃之间，在高温时容易丧失活性。本专利技术从嗜热蓝状菌Talaromyces leycettanus JCM 12802菌株中得到了一个新的纤维素酶基因，其编码的纤维素酶具有以下几个优点：嗜热、酸性、广泛的底物特异性、容易发酵生产。所有这些优点都意味着新专利技术的纤维素酶在饲料、食品、医药等行业中，将会比以前报道的纤维素酶更有应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种嗜热、酸性、底物特异性比较广泛的纤维素酶。本专利技术的再一目的是提供上述纤维素酶的基因。本专利技术的再一目的是提供包含上述纤维素酶的重组载体。本专利技术的再一目的是提供包含上述纤维素酶基因的重组菌株。本专利技术的再一目的是提供一种制备纤维素酶的方法。本专利技术的再一目的是提供上述纤维素酶的应用。本专利技术首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的新的纤维素酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1：其中，该酶全长409个氨基酸，N端18个氨基酸为信号肽序列“MKFSNVILAASASSLVLA”。因此，成熟的嗜热纤维素酶的理论分子量为42.5kDa，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2：该纤维素酶的最适pH为3.5，在pH2.5-pH5.0范围内，该酶能够维持其60％以上的酶活力；最适温度80℃，在85℃时依然具有30％的酶活力，在70℃下处理60min，酶活基本不损失，在75℃下处理5min，能够保持70％以上的酶活力，在80℃下处理2min，能够保持60％以上的酶活力，具有良好的热稳定性。本专利技术还提供了编码上述纤维素酶的基因。该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示：本专利技术通过PCR的方法分离克隆了这个纤维素酶基因，DNA全序列分析结果表明，纤维素酶结构基因全长1464bp，含有4个内含子，+96～162，+374～429，+495～551，
+650～7.3为其内含子序列，cDNA长1230bp，其cDNA序列如SEQ ID NO.4所示：其中，信号肽的碱基序列为：“ATGAAGTTTT CCAACGTGAT TCTTGCGGCC AGCGCGTCGA GCCTGGTGCT CGCT”因此，成熟基因的编码序列为SEQ ID NO.5所示：该酶属于糖基水解酶第5家族。将纤维素酶基因cDNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对确定该纤维素酶是一种新的纤维素酶。本专利技术还提供了包含上述纤维素酶基因的重组载体，优选为毕赤酵母表达载体。将本专利技术的纤维素酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本专利技术的一个最优选的实施方案，优选为将纤维素酶基因cDNA插入到质粒pPIC9上的SnaBI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒。本专利技术还提供了包含上述纤维素酶基因的重组菌株，优选为重组毕赤酵母菌株。本专利技术还提供了一种制备纤维素酶的方法，包括以下步骤：1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶的表达；以及3)回收并纯化所表达的纤维素酶。其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株。本专利技术还提供了上述纤维素酶的应用。运用基因工程手段来产业化生产纤维素酶。本专利技术提供了一个新的纤维素酶，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本专利技术的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的纤维素酶。附图说明图1纤维素酶在毕赤酵母中表达的SDS-PAGE分析。图2本专利技术重组纤维素酶的最适pH值。图3本专利技术纤维素酶的pH稳定性。图4本专利技术纤维素酶最适反应温度。图5本专利技术纤维素酶热稳定性。具体实施方式试验材料和试剂1、菌株及载体：毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)为本实验室保存；毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基：(I)产酶培养基：30g/L麦麸，30g/L玉米芯粉，30g/L豆粕，5g/L大麦葡聚糖，5g/L(NH4)SO4，1g/L KH2PO4，0.5g/LMgSO4·7H2O，0.01g/L FeSO4·7H2O，0.2g/L CaCl2于1L去离子水中，121℃，15磅条件下灭菌处理20min(2)大肠杆菌培养基LB(126蛋白胨、0.5％酵母提取物、126NaCI，pH7.O)。(3)BMGY培养基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.000049<Biotin，1％甘油(v/v)。(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1 纤维素酶编码基因的克隆提取Talaromyces leycettanus JCM 12802基因组DNA，设计克隆引物F：atgaagttttccaacgtgattcttgcggc和R本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嗜热纤维素酶，其特征在于，所述嗜热纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种嗜热纤维素酶，其特征在于，所述嗜热纤维素酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示。2.一种嗜热纤维素酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的嗜热纤维素酶。3.根据权利要求2所述的嗜热纤维素酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。4.包含权利要求2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚斌，罗会颖，郑菲，王苑，苏小运，柏映国，黄火清，王亚茹，马锐，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11