本发明专利技术公开了一种采用人工克隆、表达的重组牛肠道病毒2型VP1+蛋白，在原核系统中高效表达、纯化，以此为抗原建立了检测牛肠道病毒2型特异性抗体的间接ELISA方法，并研制出试剂盒，适用于对牛血清中的牛肠道病毒2型抗体进行检测，属于动物检验检疫领域。本发明专利技术的优点是：1)简便快速：可快速的对活牛体内的牛肠道病毒2型抗体作出评价。2)特异：与常见的牛病毒性疾病IBRV、BVDV、BLV的阳性血清不发生交叉反应。3)稳定：重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好。4)安全：不接触病毒，不具有生物安全问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及采用ELISA方法检测牛肠道病毒2型(BEV-2)特异性抗体的检测试剂盒，尤指一种间接ELISA检测试剂盒，适用于感染后牛血清中BEV-2特异性抗体的检测，属于动物检验检疫领域。
技术介绍
牛肠道病毒(Bovine enterovirus，BEV)是小RNA病毒科(Picornaviridae)、肠道病毒属(Enterovirus)成员。小RNA病毒是一个极为繁杂的病毒科，可分为鼻病毒属、口蹄疫病毒属、肠道病毒属、心病毒属和甲肝病毒属等若干个属，共200多种病毒，能引起人和动物的多种疾病，如甲肝、口蹄疫等，在医学和兽医学研究中均具有重大意义。目前针对BEV进行检测技术研究具有重大意义，原因如下：1、一种综合征可由不同病毒所引起，同一种(型)病毒可以导致不同综合征；2、感染肠道病毒后多数为亚临床表现，不易被发现；3、普遍分布于世界各地，感染广泛存在，并且常引起暴发；4、在环境中非常稳定，能在环境中存在很长时间；——这些是肠道病毒属病毒感染的普遍现象。5、BEV感染宿主范围非常广泛，能引起多种动物感染，包括人类。因此，对牛肠道病毒的监测、检测和药物治疗应该给以足够重视。肠道病毒多数情况下不引起明显严重的临床症状，但是在某些情况下，会引起各种临床综合征，导致严重疾病，例如人的脊髓灰质炎病毒、柯萨基病毒、人肠细胞病变孤儿病毒(简称埃可病毒)，猪水疱病病毒、猪传染性脑脊髓炎病毒，以及鸭肝炎病毒等。近年来频繁爆发、并且致死率较高，严重危害儿童健康的手足口病(Hand-Foot-Mouth disease，HFMD)就是由肠道病毒引起的一种常见疾病。其病原体复杂，引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，包括柯萨奇病毒A组的16、4、5、9、10型等，B组的2、5型等，以及肠道病毒71型等，其中以柯萨奇病毒A16型(CA16)和肠道病毒71型(EV 71)最为常见。EV71病毒与CA16型病毒感染虽然在临床表现上比较接近，但EV71病毒还可以引起如无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹等多种中枢神经系统疾病，致死率较高，因此备受关注。手足口病于2008年5月被列入《中华人民共和国传染病防治法》法定丙类传染病。目前，对BEV的研究不是很多，目前没有BEV引起严重疾病的报道，但是正因为研究不多，不够透彻，我们完全可以推论BEV的某些亚型可能会有高致病性。2005年初北京的牛场中发生BEV感染，严重影响了畜牧业生产。部分牛场的产奶牛普遍出现了严重腹泻症状：水样腹泻，有泡沫，少数严重的还有鲜血，体温变化不明显，食欲下降，死亡率不高，但产奶量大幅下降，并且在康复后大多数奶牛的产奶量仍不能恢复到病前的水平，特别是日产35千克以上高产奶牛；一半以上的奶牛的产奶量第二年仍无法恢复到病前的水平，严重降低了生产性能，并且还有污染奶制品的可能。跟踪调查显示目前该病两年就发生一次。我们在发病的牛场中已经分离到了BEV-2毒株，并进行了全基因测序。这或许正是BEV某些亚型具有高致病性的表现。BEV分布非常广泛，自1959年Moll和Davis首次分离到BEV以来，全世界很多国家和地区，如德国、澳大利亚、美国、英国、北爱尔兰、日本、法国、俄罗斯等国家和地区，先后报道了BEV的感染情况。根据这些报道，BEV呈地方流行性感染，可以从发生腹泻、呼吸系统疾病以及流产等广泛种类的临床症状的牛体内分离到，但更多的是从无任何临床症状的健康牛体内分离到的，有超过90％的感染牛无症状，这一点与人肠道病毒感染很相似。BEV在环境中非常的稳定，可在动物粪便以及附近被污染的水源中发现。目前的数据说明病毒可以在 环境中存在很长时间，并被牛群中的许多动物所散发。调查西班牙周边地区不同牛群的BEV流行情况，结果显示78％的粪便样品是阳性的。部分研究表明在牛群密集型及内包型放牧很普遍的区域，检测到70％的水样中存在牛肠道病毒RNA；但是在广延性的放牧地区，却没有在水样中检测到BEV阳性。因此，分享草场和水源的动物的密度越大，BEV的环境危险也就越高。另外，BEV样序列也曾出现在同一地理区域中的贝壳中，以及绵羊、山羊、马和鹿的粪便中，核苷酸序列分析显示，BEV分离株为异源性的，而且出现种特异性的变异株。这有可能是含有BEV的牛粪便污染造成的，也有可能是这些动物感染了BEV。因为有研究表明牛肠道病毒1型(BEV-1)感染宿主范围非常广泛，包括人类。在这项研究中，在8个哺乳动物物种中对BEV-1的感染情况进行了血清流行病学调查。血清样品分别采自来自土耳其不同地区的244个人，1520头牛，272匹马，126条狗，281只绵羊，477只山羊，18头骆驼(单峰驼)和82头瞪羚。微量中和试验表明，羚羊和骆驼没有任何血清阳性反应，但其他动物血清都有不同程度的阳性反应，阳性率分别为人(30.3％)，牛(64.8％)，马(12.8％)，狗(3.2％)，绵羊(32.8％)和山羊(27.6％)。因此，BEV有引起人类疾病的危险存在。综上所述，我们认为BEV虽然目前还不是进出境检验检疫中的法定检疫项目，但随着人们对它认识的加深，和对公共卫生安全的重视日益加强，BEV很有可能象猪链球菌2型一样被列为出入境检疫中的法检项目，在这种情况下我们提前针对BEV建立快速、准确、敏感的诊断方法，进行技术储备显得格外重要。目前对病毒的检测方法主要包括病原学检测方法，分子生物学检测方法以及血清学检测方法。病原学检测方法包括病毒分离鉴定、荧光抗体检测方法、免疫过氧化物酶方法以及双抗体夹心酶联免疫吸附试验(以下简称ELISA)。分子生物学检测方法有荧光PCR、普通PCR、核酸分子杂交、基因芯片等。血清学检测方法包括中和试验、补体结合反应、琼脂免疫扩散试验、凝集试验、ELISA等。在这些方法中，ELISA是酶免疫测定技术中应用最广的技术，具有灵敏度高(可达ng甚至pg水平)、特异性强、操作简单、快速、稳定及易于自动化操作(有商品化的全自动酶标分析仪)等特点，并且对环境没有污染。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本，因此也适合于血清流行病学调查。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法有多种：用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等。目前关于研究检测BEV和其抗体的ELISA方法的报道较少，目前尚未有采用原核表达的重组蛋白建立ELISA检测方法。同重组抗原方法相比，纯化等量的全病毒或病毒亚单位相对更为耗时和昂贵。VP1抗原稳定而且不具有感染性，适合于作为ELISA检测的抗原。为进一步建立能满足国际贸易需求的标准化检测试剂，我们开展了本研究。本研究利用IPTG诱导表达VP1+蛋白，经包涵体的洗涤、溶解和复性，获得较高纯度的目的蛋白，同时，通过方阵滴定初步建立了检测BEV抗体的间接ELISA方法，并对临床样品进行了检测，为试剂盒的标准化和商品化奠定基础。本专利技术首次采用原核表达的重组蛋白应用于牛肠道病毒2型抗体的检测，制备纯化了重组蛋白，建立了间接ELISA检测方法，研制出了检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是人工克隆一段含有牛肠道病毒VP1蛋白的核酸片段，实现其高效表达，并将表达的重组蛋白纯化，作为包被抗原，建立重本文档来自技高网...
【技术保护点】
设计特异性引物，采用RT‑PCR方法扩增BEV‑2包含VP1(840bp)蛋白基因片段的VP1+(1275bp)序列，并于原核载体pET‑32a实现其高效表达。下面为扩增时设计的引物序列：BEV2‑VP1‑f：5′‑CCGGAATTCTGGGATTTCGGGCTAC‑3′BEV2‑VP1‑r：5′‑CCCAAGCTTTCACACCACTAGTACAG‑3′
【技术特征摘要】
1.设计特异性引物，采用RT-PCR方法扩增BEV-2包含VP1(840bp)蛋白基因片段的VP1+(1275bp)序列，并于原核载体pET-32a实现其高效表达。下面为扩增时设计的引物序列：BEV2-VP1-f：5′-CCGGAATTCTGGGATTTCGGGCTAC-3′BEV2-VP1-r：5′-CCCAAGCTTTCACACCACTAGTACAG-3′2.一种检测牛肠道病毒2型抗体的间接ELISA试剂盒，96tests×2/盒，由以下组分组成：1)包被有牛肠道病毒2型抗原的重组酶标反应板：将纯化的重组蛋白用包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)稀释为1.56μg/mL，100μL/孔加入酶标反应板，包被条件为37℃1h，然后于4℃条件下过夜。弃去孔内液体，然后用洗涤液(PBST)洗涤3遍，排干反应板，加入含1％牛血清白蛋白的PBST，100μL/孔，37℃封闭2h，弃去孔内液体，然后用洗涤液(PBST)洗涤3遍，排干反应板，然后真空包装，存于4℃。2)样品稀释液：1％...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴丹，刘艳华，郭金玉，谷强，高志强，吴涛，张鹤晓，张乐萃，郭铮蕾，韩玥，范斐，徐姗，汪琳，张伟，蒲静，乔彩霞，柏亚铎，
申请(专利权)人：中华人民共和国北京出入境检验检疫局，中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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