一种蚯蚓多肽、其编码序列及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种蚯蚓多肽、其编码序列及其应用。揭示了一种来源于蚯蚓的新的多肽，编码该多肽的多核苷酸，该多肽具有抗肿瘤的功能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术和医学领域：更具体地，本专利技术涉及分离自蚯蚓的一种具有抗肿瘤功能的多肽，编码该多肽的多核苷酸，以及该多肽的应用。
技术介绍
蚯蚓俗称曲蟮，中药称地龙，地龙性寒味咸，具有清热、平肝、止喘、降压、抑菌及活血化瘀等功效，已广泛应用于中医中药中治疗多种疾病，如高热狂燥，惊风抽搐，风热头痛，目赤、半身不遂等。到了上世纪80年代，又陆续报道蚯蚓抽提物对多种癌细胞具有抑制作用，并在初步临床应用中取得了一定的抑癌效果(第四军医大学学报，1986，7(2)：85；中国肿瘤临床，1991，18(2)：131；生物化学与生物物理学报，2002，34(5)：576；肿瘤医学杂志，2007，12(1)：16；江苏医药，2008，34(4)：383)。在中国专利ZL200510112490.5中，揭示了一种分离自威廉腔环蚓广谱抑制癌细胞生长的蚯蚓蛋白，命名为“EFE6蛋白”。但是，蚯蚓中是否还有对于抑癌有效的成份及其作用机理目前仍然知之甚少，本领域有必要进行进一步的研究探索，找到其它有效成分。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种蚯蚓多肽、其编码序列及其应用。在本专利技术的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组：(a)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个，更佳地1-20个，更佳地1-10个，更佳地1-5个或1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗肿瘤功能的由(a)衍生的多肽；(c)与SEQ ID NO:2氨基酸序列具有80％以上(较佳地90％以上；更佳地
95％以上；更佳地98％以上或99％以上)的序列相同性的，且具有抗肿瘤功能的多肽；(d)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的片段，其具有抗肿瘤功能；或(e)在(a)多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列构成的多肽。在本专利技术的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码所述的多肽。在一个优选例中，该多核苷酸具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。在本专利技术的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。在本专利技术的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体。在一个优选例中，所述的宿主细胞不是可繁殖为动植物的细胞。在本专利技术的另一方面，提供一种制备所述多肽的方法，该方法包含：(1)培养所述的宿主细胞；(2)从培养物中分离出所述的多肽。在本专利技术的另一方面，提供所述的多肽的用途，所述的多肽用于制备抑制肿瘤的药物。在本专利技术的另一方面，提供一种用于制备抑制肿瘤的药物组合物，它含有所述的多肽(较佳地，该多肽在药物组合物中为安全有效量的)以及药学上可接受的载体。在本专利技术的另一方面，提供一种用于制备抑制肿瘤的药盒，所述药盒中包含所述的药物组合物。在本专利技术的另一方面，提供一种能与所述的多肽特异性结合的抗体。在本专利技术的另一方面，提供一种抑制肿瘤的方法，所述方法包括：给予肿瘤患者有效量的所述的多肽，或给予肿瘤患者所述的药物组合物。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、蚯蚓抑癌蛋白质在HPLC中的层析图谱。其中，星号所示的峰为感兴趣的抗肿瘤多肽组分的峰。图2、从蚯蚓中分离的抑制肿瘤细胞的蛋白质的SDS-PAGE图谱。其中，泳道1为标准分子量蛋白Marker，泳道2、3为上样量不同的抗肿瘤多肽。图3、蚯蚓抗肿瘤多肽的质谱鉴定结果。图4、蚯蚓抗肿瘤多肽的N-端测序结果。图5、蚯蚓抗肿瘤多肽PCR扩增产物的电泳条带。其中，泳道1为DNA标准，泳道2、3为PCR扩增产物的电泳结果。图6、蚯蚓抗肿瘤多肽的基因序列及其编码的蛋白质序列。图7、蚯蚓抗肿瘤多肽对多种癌细胞生长的抑制作用。具体实施方式本专利技术人致力于抗肿瘤功能性多肽的研究，经过广泛而深入的研究，揭示了一种来源于蚯蚓的新的多肽，该多肽具有抗肿瘤的功能以及水解纤维蛋白的功能。本专利技术人首先从赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)抽提物中分离到一种分子量为24663.0道尔顿的抑制肿瘤细胞生长的多肽，测定了该多肽N端的一端氨基酸序列为NH2-V-I-G-G-T-D-A-A-P-G-E-F-P-W-Q-L-(SEQ ID NO：3)，并以此为依据合成了相应的简并引物。然后，利用新鲜的活体赤子爱胜蚓分离抽提总RNA，以此RNA为模板经反转录获得cDNA，用PCR法扩增和克隆了蚯
蚓抗肿瘤多肽的基因，然后将蚯蚓抗肿瘤多肽的编码序列插入到T载体并转入到合适的宿主细胞中进行扩增，进而测定了该多肽的基因的全序列，翻译得到该抗肿瘤多肽完整的氨基酸序列。如本文所用，“分离的”是指物质从原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其它物质分开，则为分离纯化的。如本文所用，“分离的多肽(或蛋白)”是指所述多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白质、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化该蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。多肽的纯度能用于氨基酸序列分析。如本文所用，所述的“抗肿瘤多肽”与“抑癌多肽”可互换使用；所述的“抗肿瘤功能”与“抑癌功能”可互换使用。本专利技术还包括所述的抗肿瘤多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本专利技术的来源于蚯蚓的天然抗肿瘤多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本专利技术的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守行氨基酸残基(优先保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白质原序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本专利技术中，术语“抗肿瘤多肽”指具有抑癌活性的SEQ ID NO:2序列的多肽。该术语还包括具有与所述的抗肿瘤多肽相同功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能
相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括了所述的抗肿瘤多肽的活性片段和/或活性衍生物。该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与所述抗肿瘤多肽的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质、以及利用抗所述抗肿瘤多肽的抗血清获得的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组：(a)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗肿瘤功能的由(a)衍生的多肽；(c)与SEQ ID NO:2氨基酸序列具有80％以上的序列相同性的，且具有抗肿瘤功能的多肽；(d)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的片段，其具有抗肿瘤功能；或(e)在(a)多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列构成的多肽。

【技术特征摘要】
1.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组：(a)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗肿瘤功能的由(a)衍生的多肽；(c)与SEQ ID NO:2氨基酸序列具有80％以上的序列相同性的，且具有抗肿瘤功能的多肽；(d)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的片段，其具有抗肿瘤功能；或(e)在(a)多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列构成的多肽。2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码权利要求1所述多肽。3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸具有SEQ IDNO:1...

【专利技术属性】
技术研发人员：季军捷，徐少琼，李振，朱洪，张勇，郑翠玲，单辉，刘小龙，周海洋，周元聪，戚正武，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，济宁华能制药厂有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31