一种新型调节性树突状细胞的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种新型调节性树突状细胞的制备方法及联合DC‑CIK进行肿瘤免疫治疗方法。经分离哺乳动物间充质干细胞和造血干细胞；在适合细胞生长和增值的条件下，共同培养步骤中获得的哺乳动物间充质干细胞和造血干细胞；共同培养1至7天后，从悬浮培养液中回收、鉴定得到的新型调节性树突状细胞。其特征在于，所述新型调节性树突状细胞在CpGODN(CpG寡核苷酸)或具有同样诱导功能的诱导剂的诱导下转化为成熟调节性树突状细胞，其中irf4+及irf8+的表达水平增加，并且具有免疫调节功能。所述新型调节性树突状细胞能够抑制肿瘤生长，并能够联合DC‑CIK进行肿瘤免疫治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生成新型调节性树突状细胞及其在免疫治疗的用途的领域。具体地，本专利技术涉及一种利用间充质干细胞诱导造血干祖细胞分化成irf4+irf8+调节性树突状细胞regDC的方法，及其联合DC-CIK的新型免疫疗法。
技术介绍
尽管现代医学发展迅速，恶性肿瘤仍然是无法攻克的一大难题。目前，治疗恶性肿瘤的方法主要为外科手术、化学治疗、放射治疗和生物学治疗。前三种治疗方法为治疗大部分早期局限性肿瘤以及放化疗敏感性肿瘤提供了选择。但针对复发难治性肿瘤，肿瘤残留，肿瘤耐药，生物学治疗具有其他治疗方法不可替代的优势。其中，肿瘤免疫学治疗具有特异性强、适用性广、副作用轻等优点，可以有效地杀灭患者术后和放化疗后体内残存的肿瘤细胞，达到治疗肿瘤、预防复发与转移和最终根治肿瘤的目的。过继免疫疗法是通过把在体外扩增的大量特异性效应细胞回输给患者后，产生直接杀伤肿瘤细胞的作用。CIK(Cytokine Induced Killer Cell)，细胞因子诱导的杀伤细胞，是一种高效杀伤活性的异质性细胞群，外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子诱导培养产生的一群以CD3+CD56+T为主的异质细胞，包括CD4+辅助T细胞，CD8+杀伤性T细胞及NK/T细胞。具有显著的抗病毒、抗肿瘤活性，具有高效、广谱杀伤、非MHC限制的特点。其机制为：释放颗粒酶和穿孔素直接杀伤肿瘤细胞及病毒感染细胞，Fas/Fasl通路诱导肿瘤细胞凋亡，及分泌细胞因子(IFN-，TNF-，IL-6等)抑制肿瘤生长和病毒复制，提高机体免疫功能。DC-CIK是将具有高表达MHC-I、II
类分子及共刺激分子的树突状细胞(即传统型树突状细胞conventionaldendritic cell)负载肿瘤抗原，提呈给CIK细胞，进一步增强CIK免疫治疗功能的方法。目前，DC-CIK免疫过继治疗技术较成熟，在国内外得到大量应用。间充质干细胞(MSC)是存在于人体多种组织中的具有多系分化潜能的一种亚全能干细胞群。MSCs通过构成HSC耐以生存的“niche”(微环境)以及对造血功能的免疫调节两方面来调节骨髓造血功能。在动物实验及一些临床研究报道中已证实了其具有体外扩增造血干祖细胞的作用。而且，MSC具有调节多种免疫细胞功能的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有治疗恶性肿瘤技术中存在的部分问题，提供一种新型调节性树突状细胞及其生产方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种新型调节性树突状细胞的制备方法，步骤如下：(1)分离哺乳动物间充质干细胞和造血干细胞；(2)在适合细胞生长和增殖的条件下，共同培养步骤(1)中获得的哺乳动物间充质干细胞和造血干细胞；(3)共同培养1至7天后，从悬浮培养液中回收、鉴定得到的新型调节性树突状细胞。优选地，所述步骤(3)中回收得到的新型调节性树突状细胞是irf4+irf8+(irf为干扰素调节因子)的不成熟调节性树突状细胞。优选地，其中所述哺乳动物间充质干细胞分离自胎盘、骨髓、脂肪组织。优选地，其中所述哺乳动物间充质干细胞是体外培养至第1至10代的间充质干细胞。优选地，利用所述的方法得到的新型调节性树突状细胞，所述悬浮培养液中含有1％-99％的新型调节性树突状细胞。优选地，所述新型调节性树突状细胞在CpG ODN(CpG寡核苷酸)或具有同样诱导功能的诱导剂的诱导下转化为成熟调节性树突状细胞，其中irf4+及irf8+的表达水平增加，并且具有免疫调节功能。优选地，所述新型调节性树突状细胞能够促进T细胞及NK细胞增殖。优选地，所述新型调节性树突状细胞能够联合DC-CIK进行肿瘤免疫治疗。优选地，所述新型调节性树突状细胞能够能促进T细胞及NK细胞分泌IFN-γ。优选地，所述新型调节性树突状细胞能够抑制肿瘤生长。本专利技术提供的一种新型调节性树突状细胞制备方法及其具有增强T及NK细胞分泌IFN-γ及向肿瘤区迁移免疫功调节作用。在肿瘤免疫过继治疗中，采用这种新的调节性树突状细胞联合DC-CIK方案，增强CIK对肿瘤的杀伤作用，达到清除机体内残留肿瘤细胞，消除复发、转移的因素，增大治愈的可能性，延长生存时间，提高生活质量。附图说明图1：体外培养人间充质干细胞的形态；图2：人间充质干细胞的免疫表型；图3：分选后获得的外周血CD34+造血干祖细胞形态；图4：分选后获得的外周血CD34+造血干祖细胞流式检测表型；图5：人间充质干细胞与外周血造血干祖细胞共培养细胞形态，第1天；图6：人间充质干细胞与外周血造血干祖细胞共培养细胞形态，第7天；图7：流式检测间充质干细胞与造血干祖细胞共培养后获得细胞为较单一群体；图8：共培养获得细胞为树突状细胞样形态；图9：流式检测共培养获得的树突状细胞表型，提示为调节性树突状细胞；图10：western blot检测共培养获得树突状细胞为irf4、irf8低表达，经过含CpG ODN 10μg/ml孵育6h诱导成熟体外刺激后，irf4、irf8表达明显增强，为成熟调节性树突状细胞；图11-12.irf4+irf8+regDC促进CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞增殖；图13.irf4+irf8+regDC促进CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ；图14.irf4+irf8+regDC对NK细胞的促增殖作用；图15.irf4+irf8+regDC促进NK细胞分泌IFN-γ；图16.irf4+irf8+regDC与NK细胞及CD8+T细胞具有协同抗肿瘤作用；图17.irf4+irf8+regDC促进cDC，NK细胞及CD8+T细胞向肿瘤组织迁移；图18.DC-CIK流程示意图。具体实施方式为了更好地说明本专利技术，下面结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。第一方面，本专利技术方法的涉及一种获得新型树突状细胞的方法：1.间充质干细胞的获取：适用于选自不同来源健康无关供者或亲属(胎盘，骨髓，脂肪等)的，符合国际公认的定义间充质干细胞，常规标准培养方法，体外培养至第2-5代后进行后续处理。2.造血干祖细胞的获取：(采用已经明确的成熟标准方法获得)在人体：经过G-CSF标准方法动员的外周血单个核细胞混合物，或收集健康供者骨髓，CD34+造血干祖细胞含量为80％以上；3.间充质干细胞与造血干祖细胞共培养：1)共培养的时机，在共培养前12h先以2×104/ml的细胞浓度，将常规方法获得的第3代间充质干细胞接种于加入24孔板培养，以使其贴壁。12h后加入分离纯化的CD34+造血干祖细胞进行共培养。2)两种细胞数目比：间充质干细胞与造血干祖细胞之比为1∶5～1∶10。3)共培养条件：含100U/ml链霉素，100U/ml青霉素的RPMI-1640完全培养基，5％CO2，37℃恒温培养。4)耗材：可根据实验需要在24孔板、6孔板或其他具备相同功能材料。5)培养天数：1～7天。6)收获细胞方法：吸取共陪养体系悬液，PBS洗涤后，收集悬浮细胞待鉴定。7)鉴定方法：用流式细胞仪法和westernblot检测诱导生成的调节性树突状细胞表型及irf4+和irf8+蛋白表达。第二方面，本专利技术的涉及一种新型irf4+irf8+树突状细胞：来源于共培养后获得的移植物成分：含有1％～99％调本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型调节性树突状细胞的制备方法，其特征在于，步骤如下：(1)分离哺乳动物间充质干细胞和造血干细胞；(2)在适合细胞生长和增殖的条件下，共同培养步骤(1)中获得的哺乳动物间充质干细胞和造血干细胞；(3)共同培养1至7天后，从悬浮培养液中回收、鉴定得到的新型调节性树突状细胞。

【技术特征摘要】
1.一种新型调节性树突状细胞的制备方法，其特征在于，步骤如下：(1)分离哺乳动物间充质干细胞和造血干细胞；(2)在适合细胞生长和增殖的条件下，共同培养步骤(1)中获得的哺乳动物间充质干细胞和造血干细胞；(3)共同培养1至7天后，从悬浮培养液中回收、鉴定得到的新型调节性树突状细胞。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中回收得到的新型调节性树突状细胞是irf4+irf8+(irf为干扰素调节因子)的不成熟调节性树突状细胞。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物间充质干细胞分离自胎盘、骨髓、脂肪组织。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物间充质干细胞是体外培养至第1至10代的间充质干细胞。5.利用权利要求1-4任一所述的制备方法得到的新型调节性树突状细胞，其特征在于，所述悬浮培养液中...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈桦，
申请(专利权)人：青岛赛奥源生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37