本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种检测奶制品中β‑内酰胺酶核酸适配体传感器及其制备方法和应用。该适配体传感器按照以下方法制备：制备GO溶液；取梯度浓度的β‑内酰胺酶，与荧光素FAM标记的β‑内酰胺酶核酸适配体混合，在温度40℃和pH为7.2条件下孵育20min，加入GO溶液，孵育10min，测定荧光强度；确定适配体传感器标准线性曲线。基于氧化石墨烯和适配体的相互作用，建立了一种直接、快速、灵敏、特异性强的适配体传感器，利用该传感器能快速检测市面上的奶制品中非法添加的β‑内酰胺酶。这对于打击食品领域的违法犯罪行为，保障食品安全和人们健康具有重要实际意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测奶制品中β-内酰胺酶核酸适配体传感器及其制备方法和应用。
技术介绍
随着人们生活质量的逐渐提高，乳及乳制品的安全备受关注，而其中最突出的就是抗生素的残留问题。奶牛乳房炎是危害奶牛产奶的严重疾病，一直困扰乳业的健康发展，以青霉素类和头孢菌素类为代表的β-内酰胺类抗生素(β-lactamantibiotic)由于价格低廉、抗菌性强而被广泛应用于预防和治疗牛乳腺的首选药物。β-内酰胺酶(β-lactamase)是细菌产生的可水解β-内酰胺类抗生素的酶，由于β-内酰胺酶可以特异性水解青霉素及头孢类等抗生素，所以被不法分子作为解抗剂非法添加入食品或食品原料(例如牛奶和生乳)中，从而达到掩蔽抗生素的目的，影响抗生素残留检测。出于经济利益的驱动，一些不法奶站人为的使用β-内酰胺酶等生物制剂来降解牛乳中残留的抗生素，生产人造“无抗奶”。2011年广东检验检疫局技术中心的胡科锋等在广州市抽取4个品牌不同包装的牛奶20份进行检测，8个样品检出β-内酰胺酶，检出率40％；2010年5-7月，沈阳疾病预防控制中心的马景宏等从沈阳市各超市2次随机采集7个品牌不同的乳制品共50份，利用杯碟法对市售牛奶中残留的β-内酰胺酶进行检测，结果显示：7个品牌的乳制品样品50份中共有4大品牌19份样品(38％)检测结果为阳性，此种类似报道还有很多，由此可见β-内酰胺酶的滥用情况非常普遍。长期食入非法添加β-内酰胺酶的奶制品，一方面会增加人体内细菌的耐药性，降低甚至完全抵消抗生素类药物的
疗效，此外还会使过敏体质的人出现荨麻疹、发热、甚至过敏性休克等危害；另一方面在分解抗生素后，可能引进其它有害物质(如：青霉素噻唑酸等)。正因为上述危害性，中国食品整治办于2009年2月4日在《食品中可能违法添加的非食用物质名单(第二批)》中明确将β-内酰胺酶列入非食用物质，要求进行全国性监控，特别是要开展奶站和乳品企业整顿，严厉打击奶畜养殖违规添加“解抗剂”(β-内酰胺酶)的违法行为。此方法主要用于检测这种“无抗奶”的。核酸适配体(aptamer)主要指的是ssDNA或RNA的寡聚核苷酸序列，该序列能与目标靶分子高选择性、高特异性的结合。Tuerk和Gold在1990年提出一种新的体外筛选和扩增方法，命名为指数富集配体系统进化(systematicevolution of ligands by exponential enrichrnent,SELEX)技术，他们应用该筛选技术筛选得到与T4DNA聚合酶gp43高选择性、高特异性结合的RNA序列。同年，Ellington等用类似的筛选方法从RNA随机文库中筛选得到与汽巴克隆蓝、活性蓝4等小分子有机染料高特异性、高选择性的RNA分子，他们筛选得到的这些个别RNA序列命名为aptamers，它源于拉丁文词aptus，意思为“适合”。两年后，Bock等又从一个化学合成的随机DNA库中成功筛选到ssDNA适配体。Aptamer与各种配体的结合是基于单链核酸结构和空间构象的多样性，它可通过链内某些互补碱基间的配对以及静电作用、氢键作用等自身发生适应性折叠，形成一些稳定的三维空间结构，如发卡(hairpin)、假结(pseudoknot)、凸环(stem loop)、G-四分体(G-quartet)等，结合常数Kd达到微摩尔至皮摩尔范围。适配体作为一种识别分子，与传统的抗体相比具有以下优点：①亲和性和特异性高；②作用的靶分子范围更广，可以为无机金属小分子也可为生物大分子；③筛选周期短，筛选过程能自动化；④稳定性好，不易被高温、酸碱降解，可长期保存，常温下运输；⑤分子质量小，无免疫原性；⑥适配体分子较小，易于通透细胞膜进入细胞内检测细胞内的靶分子；⑦合成容易，经过修饰后具有多功能化学性质，可以参加多种反应。近年来，核酸适配体日益受到国内外化学、生物医学、纳米材料、蛋白
质科学、物理、数学多学科研究者的广泛关注。目前有关这方面的基础研究和实际应用还只处于起步阶段，面临着更大的发展空间。国内学者在适配体的相关研究中成果显著，深受国家重视。由此表明核酸适配体的基础和应用研究有着重要理论意义、实用价值和应用前景。目前对乳及乳制品中β-内酰胺酶的检测方法主要有杯碟法、头孢硝基噻吩显色法、酸度法、碘量法、高效液相色谱法等，但这些方法有些是采用化学显色的间接法来检测乳制品中残留的β-内酰胺酶，不够灵敏，而色谱法需要大型仪器和复杂的样品前处理。近年也有一些免疫分析方法，如酶联免疫法和胶体金法。国内外现已也有一些针对β-内酰胺酶快速检测的免疫试剂盒，如：华安麦科β-内酰胺酶快速检测试剂盒、SNAPβ-内酰胺酶快速检测试剂盒等。但这些试剂盒有些是利用青霉素作为酶的底物进行反应间接检测食品中β-内酰胺酶含量，可能会受到其它物质的影响。尽管也有研究者关于β-内酰胺酶胶体金免疫层析方法的研究应用，但由于有些奶制品在加工过程中会伴有一些颜色，不适合用胶体金免疫层析方法对其进行检测。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本专利技术的首要目的在于提供一种检测奶制品中β-内酰胺酶核酸适配体传感器的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供上述制备方法得到的检测奶制品中β-内酰胺酶核酸适配体传感器。本专利技术的又一目的在于提供上述检测奶制品中β-内酰胺酶核酸适配体传感器在检测奶制品中β-内酰胺酶中的应用。本专利技术目的通过以下技术方案实现：一种检测奶制品中β-内酰胺酶核酸适配体传感器的制备方法，按照以下操作步骤：(1)用石墨粉末合成氧化石墨烯；将氧化石墨烯配制成0.04mg/mL的GO溶液；(2)分别取浓度为0.5U/mL、1U/mL、5U/mL、10U/mL、14U/mL、18U/mL、22U/mL、26U/mL、30U/mL、38U/mL、46U/mL、54U/mL的β-内酰胺酶，与6nM荧光素FAM标记的β-内酰胺酶核酸适配体混合，在温度40℃和pH为7.2条件下孵育20min，然后加入步骤(1)所得GO溶液，孵育10min，测定荧光强度；所述测定荧光强度时激发波长485nm，发射波长535nm；(3)确定适配体传感器标准线性曲线为y＝4.117x+0.5241，R2＝0.999，n＝3；线性范围为1-58U/mL，R2＝0.999，最低检测线为0.5U/mL。步骤(1)所述用石墨粉末合成氧化石墨烯是采用Hummers方法进行合成，具体按照以下步骤：将3g石墨粉、70mL浓硫酸加入烧杯并置于冰水浴中，然后将2g NaNO3、9g KMnO4加入体系中；升温至35℃，维持30min；加入138ml去离子水，搅拌15min，然后加入120ml温度在60℃的3％H2O2直至溶液无明显气泡为止，将所得黄色液体，离心、酸洗、水洗、烘干、剥离，得到氧化石墨烯。步骤(2)所述β-内酰胺酶核酸适配体序列号为5’-FAM-CCAAACTCGGG-3’，在期刊Fast,W.,Sutton,L.D.,2013.公开发表过。一种由上述的制备方法得到的检测奶制品中β-内酰胺酶核酸适配体传感器。利用上述的检测奶制品中β-内酰胺酶核酸适配体传感器在检测奶制品中β-内酰胺酶中的应用。本专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测奶制品中β‑内酰胺酶核酸适配体传感器的制备方法，其特征在于按照以下操作步骤：(1)用石墨粉末合成氧化石墨烯；将氧化石墨烯配制成0.04mg/mL的GO溶液；(2)分别取浓度为0.5U/mL、1U/mL、5U/mL、10U/mL、14U/mL、18U/mL、22U/mL、26U/mL、30U/mL、38U/mL、46U/mL、54U/mL的β‑内酰胺酶，与6nM荧光素FAM标记的β‑内酰胺酶核酸适配体混合，在温度40℃和pH为7.2条件下孵育20min，然后加入步骤(1)所得GO溶液，孵育10min，测定荧光强度；所述测定荧光强度时激发波长485nm，发射波长535nm；(3)确定适配体传感器标准线性曲线为y＝4.117x+0.5241，R2＝0.999，n＝3；线性范围为1‑58U/mL，R2＝0.999，最低检测线为0.5U/mL。
【技术特征摘要】
1.一种检测奶制品中β-内酰胺酶核酸适配体传感器的制备方法，其特征在于按照以下操作步骤：(1)用石墨粉末合成氧化石墨烯；将氧化石墨烯配制成0.04mg/mL的GO溶液；(2)分别取浓度为0.5U/mL、1U/mL、5U/mL、10U/mL、14U/mL、18U/mL、22U/mL、26U/mL、30U/mL、38U/mL、46U/mL、54U/mL的β-内酰胺酶，与6nM荧光素FAM标记的β-内酰胺酶核酸适配体混合，在温度40℃和pH为7.2条件下孵育20min，然后加入步骤(1)所得GO溶液，孵育10min，测定荧光强度；所述测定荧光强度时激发波长485nm，发射波长535nm；(3)确定适配体传感器标准线性曲线为y＝4.117x+0.5241，R2＝0.999，n＝3；线性范围为1-58...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵肃清，秦静，崔锡平，吴盼盼，杨灵珊，刘洁，程安明，夏娜娜，沈定，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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