改良型β-呋喃果糖苷酶制造技术

本发明专利技术提供能够抑制蔗果四糖等副产物的生成比例、高效地生成蔗果三糖的改良型β‑呋喃果糖苷酶。一种改良型β‑呋喃果糖苷酶，其含有对β‑呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入有下述氨基酸变异的氨基酸序列；所述β‑呋喃果糖苷酶含有下述氨基酸序列：与序列号2所示的野生型β‑呋喃果糖苷酶的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列；所述氨基酸变异为：将在比对中与前述序列号2所示的野生型β‑呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的N末端起第395位的位置相当的组氨酸(H)置换为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及改良型β-呋喃果糖苷酶，尤其涉及能够有效抑制蔗果四糖等副产物的生成、高效大量地生成蔗果三糖的改良型β-呋喃果糖苷酶、含有其的氨基酸序列的多肽、编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA、含有该DNA的重组载体、将该DNA或该重组载体导入宿主而获得的转化体、改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法及使用了它们的蔗果三糖制造方法。
技术介绍
β-呋喃果糖苷酶是具有识别蔗糖中的果糖、并将蔗糖水解为果糖和葡萄糖的活性(蔗糖水解活性)的酶。β-呋喃果糖苷酶中还存在如下类型：具有将因水解而生成的果糖转移给蔗糖的活性(果糖转移活性)，从而生成由1分子葡萄糖和2分子果糖结合而成的三糖、即蔗果三糖。已知的是，蔗果三糖中的1-蔗果三糖是与蔗糖(砂糖)相似的甜味物质，产生砂糖的三分之一程度的甜度但能量仅为砂糖大约一半、即使摄取也不会使血糖值上升、发挥过敏抑制功能(专利文献1)等，因此是有用的寡糖。作为生成1-蔗果三糖的β-呋喃果糖苷酶，例如公开了在来自黑曲霉(Aspergillus niger)的β-呋喃果糖苷酶及其氨基酸序列中导入了氨基酸变异的变异体β-呋喃果糖苷酶(专利文献2)。现有技术文献专利文献专利文献1:日本专利第4162147号公报专利文献2:日本专利第3628336号公报
技术实现思路
专利技术要解决的课题在使用β-呋喃果糖苷酶制造蔗果三糖时，通常作为副产物会生成作为四糖的蔗果四糖。蔗果四糖在色谱中难以与蔗果三糖分离，即使利用色谱进行分离纯化工序也容易残留在反应液中。此外，存在于液体中的一定量以上的蔗果四糖在晶析工序中妨碍蔗果三糖的结晶化。由于这些原因，为了高效地制造蔗果三糖，需要减少蔗果四糖的生成。因此，需要一种能够减小蔗果四糖等副产物的生成比例、高效地生成蔗果三糖的β-呋喃果糖苷酶。本专利技术是为了解决这样的技术问题而作出的，目的在于，提供能够抑制蔗果四糖等副产物的生成比例、高效大量地生成蔗果三糖的改良型β-呋喃果糖苷酶、含有其的氨基酸序列的多肽、编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA、含有该DNA的重组载体、将该DNA或该重组载体导入宿主而获得的转化体、改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法及使用了它们的蔗果三糖的制造方法。用于解决课题的手段本专利技术人等进行了深入研究，结果发现，通过对β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入下述氨基酸变异，从而蔗果四糖等副产物的生成比例显著降低，蔗果三糖的生成比例增加，蔗果三糖的生成量增加；所述β-呋喃果糖苷酶含有下述氨基酸序列：与来自印度拜叶林克氏菌印度亚种NBRC3744(以下简记为“B.Indica”。)的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(序列号2)具有60％以上的同源性；所述氨基酸变异为：将在比对中与前述序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的N末端起第395位的位置相当的组氨酸(H)置换为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。此外发现，通过对前述序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶导入下述i)～iii)的氨基酸变异中的至少1种氨基酸变异，从而蔗果四糖等副产物的生成比例显著降低，蔗果三糖的生成比例增加，蔗果三糖的生成量增加，所述i)～iii)为：i)将N末端起第123位的亮氨酸(L)置换为半胱氨酸(C)的氨基酸变异、ii)将N末端起第395位的组氨酸(H)置换为精氨酸(R)或赖氨酸(K)的氨基酸变异、及iii)将N末端起第473位的苯丙氨酸(F)置换为酪氨酸(Y)的氨基酸变异。此外发现，通过对前述序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶导入下述i)及iii)的氨基酸变异中的至少1种氨基酸变异，从而低聚乳果糖(lactosucrose)的生成比例及低聚乳果糖的生成量增加，所述i)及iii)为：i)将N末端起第123位的亮氨酸(L)置换为半胱氨酸(C)的氨基酸变异、iii)将N末端起第473位的苯丙氨酸(F)置换为酪氨酸(Y)的氨基酸变异。因此，基于这些见解完成了下述的各专利技术。(1)本专利技术的改良型β-呋喃果糖苷酶的一个方式为含有对β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入有下述氨基酸变异的氨基酸序列；所述β-呋喃果糖苷酶含有与序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列；所述氨基酸变异为：将在比对中与前述序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的N末端起第395位的位置相当的组氨酸(H)置换为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。(2)本专利技术的改良型β-呋喃果糖苷酶的另一方式为含有下述(a)或(b)的氨基酸序列；(a)对序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入选自下述i)～iii)中的1或2种以上氨基酸变异的氨基酸序列；i)将N末端起第123位的亮氨酸(L)置换为半胱氨酸(C)的氨基酸变异、ii)将N末端起第395位的组氨酸(H)置换为精氨酸(R)或赖氨酸(K)的氨基酸变异、iii)将N末端起第473位的苯丙氨酸(F)置换为酪氨酸(Y)的氨基酸变异，(b)含有在氨基酸序列(a)中缺失、置换、插入或附加导入有氨基酸变异的氨基酸以外的1或数个氨基酸的氨基酸序列且具有β-呋喃果糖苷酶活性的氨基酸序列。(3)本专利技术的多肽含有(1)或(2)所述的改良型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列。(4)本专利技术的DNA编码(1)或(2)所述的改良型β-呋喃果糖苷酶。(5)本专利技术的重组载体含有(4)所述的DNA。(6)本专利技术的转化体为将(4)所述的DNA或(5)所述的重组载体导入宿主而获得的转化体。(7)本专利技术的转化体中，导入有(4)所述的DNA或(5)所述的重组载体的宿主可以是大肠杆菌。(8)本专利技术的改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法具有下述工序：由将(6)或(7)所述的转化体培养而得到的培养物，获得改良型β-呋喃果糖苷酶的工序。(9)本专利技术的蔗果三糖的制造方法具有下述工序：使(1)或(2)所述的改良型β-呋喃果糖苷酶、(6)或(7)所述的转化体或培养(6)或(7)所述的转化体而获得的培养物与蔗糖接触。专利技术的效果根据本专利技术的改良型β-呋喃果糖苷酶、本专利技术的转化体、本专利技术的蔗果三糖的制造方法，能够抑制蔗果四糖等副产物的生成比例、高效大量地制造蔗果三糖。此外，根据本专利技术的多肽、本专利技术的DNA、本专利技术的重组载体、本专利技术的转化体、本专利技术的改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法，能够获得可抑制蔗果四糖的生成比例、高效大量地制造蔗果三糖的改良型β-呋喃果糖苷酶。附图说明图1为示出利用导入有pCDF-Indica重组载体(上图)及pCDFDuet-1质粒(下图)的重组大肠杆菌进行蔗果三糖生成反应而得的反应液中所含有的各糖的比率的HPLC色谱图。具体实施方式以下对本专利技术的改良型β-呋喃果糖苷酶、多肽、DNA、重组载体、转化体、改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法及蔗果三糖的制造方法进行详细说明。蔗果三糖通常是果糖结合在蔗糖上而生成的，根据果糖所结合的位置可生成1-蔗果三糖、6-蔗果三糖及新蔗果三糖这3种。即，1-蔗果三糖是果糖与蔗糖中的果糖单元形成β(2→1)键而生成的，6-蔗果三糖是果糖与蔗糖中的果糖单元形成β(2→6)键而生成的，新蔗果三糖是果糖与蔗糖中的葡萄糖单元形成β(2→6)键而生成的。此外，蔗果四糖是果糖与1-蔗果三糖中的果糖单元形成β(2→1)键而生成的四糖。本专利技术中的“蔗果三糖”是指1分子葡本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改良型β‑呋喃果糖苷酶，其含有对β‑呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入有下述氨基酸变异的氨基酸序列；所述β‑呋喃果糖苷酶含有与序列号2所示的野生型β‑呋喃果糖苷酶的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列；所述氨基酸变异为：将在比对中与前述序列号2所示的野生型β‑呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的N末端起第395位的位置相当的组氨酸(H)置换为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.27 JP 2013-2734021.一种改良型β-呋喃果糖苷酶，其含有对β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入有下述氨基酸变异的氨基酸序列；所述β-呋喃果糖苷酶含有与序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列；所述氨基酸变异为：将在比对中与前述序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的N末端起第395位的位置相当的组氨酸(H)置换为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。2.一种改良型β-呋喃果糖苷酶，其含有下述(a)或(b)的氨基酸序列；(a)对序列号2所示的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入选自下述i)～iii)中的1或2种以上氨基酸变异的氨基酸序列；i)将N末端起第123位的亮氨酸(L)置换为半胱氨酸(C)的氨基酸变异、ii)将N末端起第395位的组氨酸(H)置换为精氨酸(R)或赖氨酸(K)的氨基酸变异、iii)将N末端起第473位的苯丙氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：栃尾巧，中村早岐，八原美沙，藤井匡，田村圭辅，
申请(专利权)人：物产食品科技股份有限公司，日本迈科洛生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：日本;JP