本发明专利技术公开了一种可与质谱直接联用的蛋白质在线分析PMMA芯片及其制备方法，本发明专利技术先分别在PMMA基片和PMMA盖片上集成微型通道和电喷雾电极，然后进行封合，接着利用切割、打磨等机械加工技术在芯片通道末端制备了与质谱连接的接口即电喷雾喷嘴，然后利用表面改性结合化学修饰的方法在芯片通道内集成酶反应器，最后得到用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片；所制备的芯片特点是集成化程度高、制作成本低。该PMMA芯片集成有微型通道、固定化酶反应器、电喷雾喷嘴和电喷雾电极，可与ESI质谱直接联用进行蛋白质在线分析。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及在芯片加工领域中的一种利用微细加工和化学修饰手段制备集成有微型通道、固定化酶反应器、电喷雾喷嘴和电极的，可与质谱联用的蛋白质分析芯片的方法。
技术介绍
蛋白质组学研究是21世纪生命科学的研究热点之一。生物质谱由于其可以提供试样组份中生物大分子的基本结构和定量信息，因此在蛋白质研究中具有巨大的潜力。进入质谱检测前，蛋白质必须先进行酶解处理，这个前处理是必不可少的。在传统蛋白质分析中，蛋白质先经过常规的溶液中酶解，然后收集酶解液进质谱检测分析。常规溶酶解蛋白质的反应时间长，一般需要十几个小时以上，且存在严重的酶自降解现象。这大大阻碍了蛋白质的快速有效分析。微流控芯片可以集成常规分析系统中的试样引入、预处理、反应、分离、检测等众多功能单元，具有微型化、集成化、自动化、便携化等众多优点，越来越受到各界的关注。聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)由于其光学性能好、生物兼容性好、玻璃化温度较低、加工方便成本低等优势而被广泛地用于制作各种微流控芯片。微流控芯片由于其通道特性，在通道内反应速度较常规溶液中快。因此，芯片通道内的酶解可以很大程度地减小酶解时间。此外，将蛋白酶固定在通道表面，可以提高酶与底物的接触面积，从而大大提高了酶解反应效率，实现快速酶解。因此，文献中有报道将胰蛋白酶固定在通道表面，然后蛋白质样品通入芯片酶解后直接与基质混合转移至MALDI板上进行检测，大大缩短了酶解时间，实现了自动快速酶解。但可以看出，实验过程中仍需收集酶解液进行离线检测，蛋白质酶解和质谱检测这两个步骤仍是独立依次进行，耗时耗力，不能实现在线快速自动酶解、在线质谱检测。专利技术内容本专利技术要解决的技术问题是提供一种用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片及其制备方法，采用本专利技术的方法能得到集成有微型通道、固定化酶反应器、电喷雾喷嘴和电喷雾电极的，可与ESI质谱直接联用进行蛋白质分析的PMMA芯片。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制备方法，包括以下步骤：1)、在PMMA基片的正面集成微型通道，得带有通道的PMMA基片；所述微型通道的末端通道与PMMA基片的中心线相重合；2)、在PMMA盖片的正面集成电喷雾电极，得带有电极的PMMA盖片；所述电喷雾电极包括2个电极块和一根电极线，所述2个电极块分别位于PMMA盖片的中心线的两端，且2个电极块通过电极线相连通；3)、将带有通道的PMMA基片以末端通道(即，PMMA基片的中心线)为角平分线切割形成尖角；将带有电极的PMMA盖片切割形成与PMMA基片的尖角相吻合的尖角；4)、将步骤3)所得的切割后PMMA基片和切割后PMMA盖片均置于紫外灯下，进行紫外光辐射处理；5)、将步骤4)所得的辐射处理后PMMA基片和辐射处理后PMMA盖片进行封合，得PMMA芯片；PMMA基片的正面与PMMA盖片的正面相贴合(即，通道面与电极面相贴合)，PMMA基片的中心线与PMMA盖片的中心线相重合，形成PMMA基片尖角的两个斜面与形成PMMA盖片尖角的两个斜面相对应的吻合，所述电极线垂直横跨末端通道；打磨PMMA芯片的尖角(由PMMA基片尖角和PMMA盖片尖角组合形成)，使尖角处的PMMA芯片的厚度为0.65～0.75mm，PMMA芯片尖端设置电喷雾喷嘴；所述电喷雾喷嘴与末端通道相连通；所述电极线与末端通道的交叉点距离电喷雾喷嘴(4)0.45～0.55cm；6)、先向微型通道内充满乙二胺溶液，室温反应2～3小时，反应结束后用纯净水冲洗微型通道；再向微型通道(1)内充满戊二醛溶液，室温反应10～16小时，反应结束后用用50mmol/LpH＝7.0的磷酸缓冲液冲洗微型通道；最后向微型通道内充满蛋白酶溶液，3～5℃下反应22～26h(较佳为4℃下反应24h)，反应结束后用纯净水冲洗微型通道；得用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片。备注说明：该用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片为集成有微型通道、固定化酶反应器、电喷雾喷嘴和电喷雾电极的，可与ESI质谱直接联用进行的PMMA芯片。在步骤4)中，PMMA基片和PMMA盖片经紫外光辐射处理后，表面会产生羧基等基团；羧基与乙二胺溶液反应，微型通道的表面修饰上氨基基团；氨基基团与戊二醛溶液反应，微型通道的表面修饰上醛基基团；蛋白酶与微型通道表面的醛基反应从而修饰到微型通道的表面。在本专利技术中，室温一般是指15～25℃。作为本专利技术的用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制备方法的改进：PMMA盖片的宽度大于PMMA基片的宽度，从而使PMMA盖片上的2个电极块均不会被PMMA基片所完全覆盖。备注说明：PMMA盖片上的电极块需要外漏出来，这样实际使用时电极夹才能夹住电极块，才能施加电压。作为本专利技术的用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制备方法的进一步改进：在PMMA基片的反面分别设置样品进样口和辅助溶液进样口；所述样品进样口和辅助溶液进样口与微型通道相连通；且辅助溶液进样口与末端通道的交叉点距离电喷雾喷嘴0.5～1cm。备注说明：辅助溶液进样口与末端通道的交叉点、电极线与末端通道的交叉点是两个不同的点，但也可以相重叠。作为本专利技术的用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制备方法的进一步改进：所述步骤4)中的紫外光辐射处理为：于2.10mW/cm2的辐射强度下辐射1～3h。备注说明：利用能产生臭氧的低压汞灯作为紫外灯，其辐射的主要紫外为254nm。作为本专利技术的用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制备方法的进一步改进：所述乙二胺溶液的配制方法为：将0.3～0.4mol的乙二胺、45～55mmol(较佳为50mmol)的EDC，用50～100mmol/L pH＝7.0的磷酸缓冲液定容至1L；所述戊二醛溶液的配制方法为：将戊二醛与50mmol/L pH＝7.0的磷酸缓冲液混合形成戊二醛溶液，所述戊二醛溶液中戊二醛的体积浓度为5％；所述蛋白酶溶液的配制方法为：将5mg胰蛋白酶用50mmol/L pH＝7.0的磷酸缓冲液定容至5mL。作为本专利技术的用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制备方法的进一步改进：所述微型通道(1)可以通过热压法、激光烧蚀法或数控铣床等方法制备所得。其通道构型可以根据需要调整。作为本专利技术的用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制备方法的进一步改进：电极块和电极线均由金属材料(例如金、铜、银等)制成；采用紫外光诱导化学镀技术在PMMA盖片上集成。作为本专利技术的用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制备方法的进一步改进：PMMA基片上的尖角为直角或锐角。作为本专利技术的用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制备方法的进一步改进：所述步骤5)的封合为常温加压封合。在本专利技术中，PMMA即是指聚甲基丙烯酸甲酯。综上所述，本专利技术旨在提供一种可与质谱直接联用的蛋白质在线分析PMMA芯片的制备方法。先分别在PMMA基片和PMMA盖片上集成微型通道和电喷雾电极，然后进行封合，接着利用切割、打磨等机械加工技术在芯片通道末端制备了与质谱连接的接口即电喷雾喷嘴，然后利用表面改性结合化学修饰的方法在芯片通道内集成酶反应器，最后得到用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片；其制备的芯片特点是集成化程度高、制作成本低。该PMMA芯片集成有微型通道、固定本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制备方法，其特征是包括以下步骤：1)、在PMMA基片的正面集成微型通道(1)，得带有通道的PMMA基片；所述微型通道(1)的末端通道(11)与PMMA基片的中心线相重合；2)、在PMMA盖片的正面集成电喷雾电极，得带有电极的PMMA盖片；所述电喷雾电极包括2个电极块(2)和一根电极线(3)，所述2个电极块(2)分别位于PMMA盖片的中心线的两端，且2个电极块(2)通过电极线(3)相连通；3)、将带有通道的PMMA基片以末端通道(11)为角平分线切割形成尖角；将带有电极的PMMA盖片切割形成与PMMA基片的尖角相吻合的尖角；4)、将步骤3)所得的切割后PMMA基片和切割后PMMA盖片均置于紫外灯下，进行紫外光辐射处理；5)、将步骤4)所得的辐射处理后PMMA基片和辐射处理后PMMA盖片进行封合，得PMMA芯片；PMMA基片的正面与PMMA盖片的正面相贴合，PMMA基片的中心线与PMMA盖片的中心线相重合，形成PMMA基片尖角的两个斜面与形成PMMA盖片尖角的两个斜面相对应的吻合，所述电极线(3)垂直横跨末端通道(11)；打磨PMMA芯片的尖角，使尖角处的PMMA芯片的厚度为0.65～0.75mm，PMMA芯片尖端设置电喷雾喷嘴(4)；所述电喷雾喷嘴(4)与末端通道(11)相连通；所述电极线(3)与末端通道(11)的交叉点(7)距离电喷雾喷嘴(4)0.45～0.55cm；6)、先向微型通道(1)内充满乙二胺溶液，室温反应2～3小时，反应结束后用纯净水冲洗微型通道(1)；再向微型通道(1)内充满戊二醛溶液，室温反应10～16小时，反应结束后用用50mmol/L pH＝7.0的磷酸缓冲液冲洗微型通道(1)；最后向微型通道(1)内充满蛋白酶溶液，3～5℃下反应22～26h，反应结束后用纯净水冲洗微型通道(1)；得用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片。...
【技术特征摘要】
1.用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制备方法，其特征是包括以下步骤：1)、在PMMA基片的正面集成微型通道(1)，得带有通道的PMMA基片；所述微型通道(1)的末端通道(11)与PMMA基片的中心线相重合；2)、在PMMA盖片的正面集成电喷雾电极，得带有电极的PMMA盖片；所述电喷雾电极包括2个电极块(2)和一根电极线(3)，所述2个电极块(2)分别位于PMMA盖片的中心线的两端，且2个电极块(2)通过电极线(3)相连通；3)、将带有通道的PMMA基片以末端通道(11)为角平分线切割形成尖角；将带有电极的PMMA盖片切割形成与PMMA基片的尖角相吻合的尖角；4)、将步骤3)所得的切割后PMMA基片和切割后PMMA盖片均置于紫外灯下，进行紫外光辐射处理；5)、将步骤4)所得的辐射处理后PMMA基片和辐射处理后PMMA盖片进行封合，得PMMA芯片；PMMA基片的正面与PMMA盖片的正面相贴合，PMMA基片的中心线与PMMA盖片的中心线相重合，形成PMMA基片尖角的两个斜面与形成PMMA盖片尖角的两个斜面相对应的吻合，所述电极线(3)垂直横跨末端通道(11)；打磨PMMA芯片的尖角，使尖角处的PMMA芯片的厚度为0.65～0.75mm，PMMA芯片尖端设置电喷雾喷嘴(4)；所述电喷雾喷嘴(4)与末端通道(11)相连通；所述电极线(3)与末端通道(11)的交叉点(7)距离电喷雾喷嘴(4)0.45～0.55cm；6)、先向微型通道(1)内充满乙二胺溶液，室温反应2～3小时，反应结束后用纯净水冲洗微型通道(1)；再向微型通道(1)内充满戊二醛溶液，室温反应10～16小时，反应结束后用用50mmol/LpH＝7.0的磷酸缓冲液冲洗微型通道(1)；最后向微型通道(1)内充满蛋白酶溶液，3～5℃下反应22～26h，反应结束后用纯净水冲洗微型通道(1)；得用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片。2.根据权利要求1所述的用于蛋白质质谱在线分析的PMMA芯片的制备方法，其特征是：PMMA盖片的宽度大于...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡贤巧，卢林，朱智伟，方长云，段彬伍，于永红，何小嫣，
申请(专利权)人：中国水稻研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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