一种外泌体、外泌体的制备方法及其在制备治疗脓毒症药物或者制剂中的应用技术

本发明专利技术公开了白介素‑1β（IL‑1β）优化的脐带间充质干细胞来源外泌体在治疗脓毒症中的应用，具体涉及用重组人的IL‑1β优化处理人脐带间充质干细胞，使其免疫抑制功能增强，提取其产生的外泌体用于脓毒症的治疗。所述外泌体能有效缓解脓毒症症状，增加脓毒症小鼠的生存率，且这种外泌体还具有保存和运输方便的优势，这就为脓毒症等难治性炎症相关疾病的治疗提供了新的策略。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及间充质干细胞来源的外泌体、外泌体的制备方法及其用途，具体是用IL-1β优化处理后的间充质干细胞产生的外泌体在脓毒症治疗中的应用。
技术介绍
脓毒症(sepsis)一种严重的由感染引起的系统性炎症。其发病过程包括全身性的炎症爆发，伴随多器官功能障碍综合症、急性呼吸窘迫综合症和循环系统崩溃等，最终导致死亡。对这种疾病目前仍缺乏有效的治疗手段，其死亡率在重症病人中居高不下。自从2011年撤销Xygris和Eritoran的使用后，目前还没有针对脓毒症的有效药物。因此，急需开发新的有效的治疗手段。间充质干细胞(MSCs)是一群具有多向分化潜能的多能干细胞，几乎存在于所有组织中。除了分化功能外，MSCs还具有显著的免疫调节功能、低免疫源性、易于在体外分离培养和迅速扩增的特性，这使得MSCs在免疫性和炎症性相关疾病的细胞治疗方面备受关注。然而，最近的研究发现，静息状态的MSCs免疫调节功能很弱，疗效欠佳；在炎症因子如IFN-γ、TNF-α、IL-1β和NO等的刺激活化后，MSCs能更加有效地发挥其免疫调节功能。因此，可以在体外培养过程中用炎症因子对MSCs进行优化处理，以提高MSCs的免疫调节功能，改善其治疗效果。然而MSCs的临床应用仍面临着许多挑战，包括体外培养MSCs的不均一性、细胞注射导致的血管阻塞、细胞移植后在体内存活有限、衰老引起的遗传不稳定性或功能丧失等。更为严重的是MSCs用于临床还存在恶性转变及致瘤的可能性。鉴于这些结果，潜在的MSCs临床转化的选择应慎重考虑。值得关注的是，MSCs在静息或活化状态下能分泌大量的外泌体(exosome)，这些外泌体携带了MSCs的重要信号分子，如蛋白质、mRNAs、miRNAs和ncRNAs等，参与细胞间的通讯并调控细胞功能。许多研究证实MSCs来源的外泌体保持着与其母细胞相似的生物学功能。而外泌体的的直径足够小(30-150nm)，不仅可以快速通过毛细血管到达病损部位，还可以透过血脑屏障等其他屏障，其作用范围将比细胞更加广泛；且外泌体具有便于储存和运输的优势。同时也避免了直接注射MSCs的不利生物学效应，减少了临床风险。我们首次提取了用IL-1β优化的MSCs产生的外泌体，应用于小鼠脓毒症的治疗中，取得了良好的治疗效果。与传统的细胞治疗相比，外泌体具有稳定性好、保存及应用方便快捷的特点。与静息状态MSCs来源的外泌体(MSC-exo)相比，IL-1β优化的MSCs来源外泌体(βMSC-exo)的治疗效果更强。
技术实现思路
本专利技术提供一种IL-1β优化的人脐带间充质干细胞来源的外泌体(βMSC-exo)、该外泌体的制备方法及其在治疗脓毒症中的应用。这种外泌体能有效增加脓毒症模型小鼠的生存率，加强体内细菌清除率，降低全身炎症反应，缓解组织器官损伤的作用。本专利技术所述外泌体来源于体外优化的脐带间充质干细胞，并经过一定方法提取，可以在-80度冰箱中长期保持活性(至少1年)。制备间充质干细胞之后，将间充质干细胞按以下方法进行IL-1β的优化：取第3-7代的间充质干细胞接种于10cm培养皿中，待细胞融合达到60-70％时，加10ng/ml重组人IL-1β(美国PeproTech公司)处理12-24小时。用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞两次，更换含无外泌体胎牛血清的DMEM/F12培养基继续培养48-72小时，无菌收集培养上清，用于提取外泌体。所述的外泌体按以下方法制备而得：将收集的培养上清于4℃、2,000g离心10分钟，以去除死细胞和大的碎片；小心将上清液转移到新的无菌离心管中，于4℃、10,000g离心30分钟，以去除细胞器及小颗粒；小心将上清液转移到无菌超速离心管中，于4℃、110,000g超速离心70分钟，小心弃去上清，再加注射用生理盐水清洗一次，于4℃、110,000g超速离心70分钟，得到的沉淀即为外泌体。根据最初收集的培养基的体积不同，酌情加入注射用生理盐水重悬，用Bradford试剂盒检测总蛋白浓度，-80℃分装保存。所述的外泌体表达标志性蛋白CD63和Alix，平均直径在100nm左右，透射电镜下观察到的形态都符合外泌体的特征。本专利技术通过细胞实验证明：通过IL-1β优化的间充质干细胞(βMSCs)比静息状态的间充质干细胞(MSCs)免疫抑制功能更强，更有效地抑制T细胞增殖和活化，抑制巨噬细胞炎性因子TNF-α的分泌，而促进抗炎因子IL-10的分泌。进一步地，本专利技术首次证明βMSCs来源外泌体(βMSC-exo)比MSCs来源外泌体(MSC-exo)的免疫抑制功能更强，表现为更有效地抑制T细胞增殖和活化，抑制巨噬细胞炎性因子TNF-α的分泌，而促进抗炎因子IL-10的分泌。盲肠结扎穿刺(CLP)诱导的小动物脓毒症症状比较接近临床病患的症状，该模型被认为是最经典的脓毒症模型，已被延用了超过20年。因此，我们采用此方法构建小鼠脓毒症模型，通过尾静脉注射βMSC-exo和MSC-exo，观察外泌体对脓毒症症状的改善作用。本专利技术首次通过动物实验证明：βMSC-exo比MSC-exo更有效地增加脓毒症小鼠的生存率、加强体内细菌清除率、降低全身炎症反应并缓解肝脏和肺组织的损伤。本专利技术的有益效果是：1.本专利技术用IL-1β对MSCs进行优化处理，使MSCs的免疫抑制功能增强，从而得到的外泌体(βMSC-exo)比静息状态的MSCs外泌体(MSC-exo)的免疫抑制功能更强，对小鼠脓毒症的治疗效果更佳：βMSC-exo比MSC-exo更有效地增加脓毒症小鼠的生存率、加强体内细菌清除率、降低全身炎症反应并缓解肝脏和肺组织的损伤。因此，βMSC-exo在脓毒症等炎症相关疾病的临床治疗领域具有非常可观的应用前景。2.与传统的细胞治疗相比，本专利技术提供的外泌体可在-80度长期保存(至少1年)，溶解后即可使用，避免了MSCs冻存和复苏的不便，以及可能造成细胞活力和功能改变的风险。3.本专利技术制备的间充质干细胞外泌体原料是脐带，脐带的采集为无创性操作且属于废弃物再利用，不涉及法律伦理等问题，脐带数量充足、来源广泛，可以进行规模化生产。附图说明：图1为IL-1β处理不影响MSCs的形态。图2为IL-1β处理不影响MSCs的表面标志：灰色为MSCs，黑色为βMSCs。图3为IL-1β处理不影响MSCs的成骨和成脂分化能力：上图中被染成红褐色的为成骨细胞，下图中被染成橘红色的为脂肪细胞。图4为IL-1β处理增强了MSCs对T细胞增殖和活化的抑制作用：(A)T细胞增殖；(B)T细胞表面活化标志CD69；(C)T细胞内活化标志IFN-γ。图5为IL-1β处理增强了MSCs对巨噬细胞的抑制作用：(A)炎性因子TNF-α的分泌水平；(B)抗炎因子IL-10的分泌水平。图6为两种外泌体βMSCs-exo和MSCs-exo的鉴定：(A)western-blot检测外泌体标志蛋白CD63和Alix；(B)透射电镜观察外泌体的形态，标尺为100nm；(C)外泌体粒径分布图。图7为两种外泌体βMSCs-exo和MSCs-exo对小鼠脾脏T细胞的抑制作用：(A)T细胞表面活化标志CD69；(B)T细胞内活化标志IFN-γ。图8为两种外泌体βMSCs-exo和MSCs-exo对小鼠骨髓诱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种外泌体，其特征为：所述外泌体为IL‑1β优化的人脐带间充质干细胞来源的外泌体。

【技术特征摘要】
1.一种外泌体，其特征为：所述外泌体为IL-1β优化的人脐带间充质干细胞来源的外泌体。2.如权利要求1所述的外泌体，其特征为所述外泌体由以下方法制备：(1)分离培养人脐带间充质干细胞；(2)用IL-1β优化处理人脐带间充质干细胞；(3)收集步骤(2)中的培养基上清液，用差速离心的方法收集外泌体即得到IL-1β优化的人脐带间充质干细胞来源的外泌体。3.如权利要求1所述的外泌体，其特征为所述外泌体由以下方法制备：(1)分离培养人脐带间充质干细胞：采集正常足月妊娠剖宫产胎儿的脐带，剪取近胎盘端脐带20-30cm，置于4℃预冷的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中保存，4小时内使用；在超净工作台内，将脐带剪成5cm左右的小段，用PBS洗净脐带表面残余的血液；剥离脐动脉和脐静脉后，置于含0.01％青霉素和链霉素的DMEM/F12培养基中，用手术剪刀剪成2mm3左右的组织块；将剪碎的组织转移到50ml离心管中，4℃、300g离心，小心弃去上层培养基，加入与组织等体积的混合消化酶，置于37℃摇床中，200rpm振荡，消化1.5-2小时；其中混合消化酶含Ⅱ型胶原酶2mg/ml，中性蛋白酶0.8mg/ml，透明质酸酶0.03mg/ml，用DMEM/F12培养基配置；将消化后的组织液于4℃、400g离心10分钟，小心弃去上清；用PBS洗两次，每次4℃、400g离心10分钟，弃上清；最后将沉淀重悬于含有12％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基中，铺入T-25培养瓶，在37℃、5％CO2培养箱中培养；3天后，弃去未贴壁的细胞与组织，加入新鲜的含有10％FBS的DMEM/F12培养基；待细胞长至80％融合度时，用0.25％胰酶消化，传代至10cm培养皿中继续扩增培养，并记为第1代。以后每三到四天换液或消化后传代培养，每传代一次记为一代。(2)用IL-1β优化处理人脐带间充质干细胞：取第3-7代的间充质干细胞(MSCs)接种于10cm培养皿中，待细胞融合达到60-70％时，加入重组人IL-1β，使得终浓度为10ng/ml，处理12-24小时；用PBS清洗细胞两次，更换含10％无外泌体FBS的DMEM/F12培养基继续培养48-72小时。其中无外泌体的FBS是通过100,000g超速离心18小时后去除沉淀的FBS；(3)收集步骤(2)中的培养基上清液，用差速离心的方法收集外泌体：无菌收集步骤(2)中最后一步所得的培养基上清液于500ml无菌离心瓶或50ml聚丙烯离心管中，于4℃、2000g离心10分钟，以去除死细胞和大的碎片；小心将上清液转移到新的无菌离心管中，于4℃、10,000g离心30分钟，以去除细胞器及小颗粒；小心将上清液转移到无菌超速离心管中，于4℃、110,000g超速离心70分钟，小心弃去上清，再加注射用生理盐水清洗一次，于4℃、110,000g超速离心70分钟，得到的沉淀即为IL-1β优化的人脐带间充质干细胞来源的外泌体。用生理盐水重悬外泌体，测定蛋白浓度后-80℃分装保存。4.一种外泌体的制备方法，其特征为步骤如下：(1)分离培养人脐带间充质干细胞；(2)用IL-1β优化处理人脐带间充质干细胞；(3)收集步骤(2)中的培养基上清液，用差速离心的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯亚义，宋玉仙，窦环，泥艳红，樊竑冶，赵晓寅，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32