本发明专利技术提供了一种适用于高GC含量核酸扩增的直用型PCR扩增混合试剂。该混合试剂包括：DNA聚合酶、KCl、Tris‑HCl、MgCl2、dNTPs和甘油，溶剂为ddH2O。在某些优选的实施方案中，该混合试剂中还包括增强剂，可对只含2个拷贝的模板进行有效扩增，所述的增强剂为DMSO、NH4Cl、7H2O·MgSO4、甜菜碱、昆布氨酸、龙虾肌碱、乙二醇和山梨醇中的一种或多种。使用时，仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行PCR，大大简化操作过程，缩短操作时间，降低污染；同时，由于体系内含有增强剂，能够显著增强PCR扩增的灵敏度。该混合试剂能够实现对GC含量超过85％的核酸模板的PCR扩增。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种直用型高GC含量核酸模板的PCR扩增混合试剂。
技术介绍
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种用于扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，在某种程度上是一种生物体外的特殊DNA复制过程。PCR技术的最大特点是利用微量的DNA模板实现其大量富集。该技术于1983年，由美国Mullis首先提出设想，1985年由其专利技术了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。至今为止，PCR已发展到第四代技术。PCR是利用DNA分子在95℃左右高温时变性会变成单链，在60℃左右低温时引物与单链按碱基互补配对原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链，来实现DNA分子的体外扩增。根据以上原理，常规PCR过程一般分为变性、退火、延伸3个阶段。PCR技术发展至今已有30年左右的时间，随着分子生物学技术的不断进步，PCR技术也不断趋于完善，被利用到生物学、食品科学以及医学等各个领域，并且随之发展出各种具有针对性功能的PCR扩增试剂。随着实际应用的不断发展，对PCR扩增试剂的稳定性、便捷性以及功能性的要求不断提高。由于DNA分子中，碱基A和T之间形成2对氢键，而碱基G和C之间形成3对氢键，因此打开碱基G和C之间的链接需要的能量相对较高，也就导致高GC含量的模板在进行变性时所需的能量更高，变性困难；并且并且模板中容易形成稳定的二级结构妨碍DNA聚合酶在模板上进行DNA合成而导致扩增失败。研究人员也尝试了许多方法提高高GC含量核酸的特异性扩增效率，如热启动和两步PCR等，然而这些方法只针对某些特性靶基因扩增有一定的效果，并不具有普适性。除此之外，也有人开始对PCR反应的添加剂进行研究，获得了一批PCR试剂，能够提高高GC含量核酸的特异性扩增效率。中国专利申请CN200810167573公开了一种扩增高GC含量片段的PCR专用混合液及其应用，所述混合液为2×GC-RICH master mix，其特征在于：该混合液含有40mM Tris-HCl pH8.0，40mM KCl，3mM MgCl2，1—20％甘油，1—2％Tween—20，1mM dNTP，0.1U Taq DNA聚合酶，0.02U pfu DNA聚合酶，0.1-1M甜菜碱和0.1-1M脯氨酸。该混合液能获得保真度较高的DNA并能对一些有特殊结构如GC含量高(60％<GC％<74.8％)，有二级结构模板等进行很好地扩增。中国专利申请CN201410120471公开了一种用于高GC含量基因的PCR扩增添加剂组合物及高GC含量基因的PCR扩增方法。其中，扩增添加剂选自7-deaza-dGTP、甜菜碱或甜菜碱类似物、DMSO、甘油、甲酰胺和聚乙二醇中的2种或2种以上的组合。应用此PCR添加剂及扩增方法，可以扩增模板GC含量大于80％的目的基因，可以成功扩增复杂基因用于临床检测。虽然目前已经发展出多种适用于高GC含量的核酸分子的PCR扩增试剂，然而这些扩增试剂多为分步加样试剂，即除了模板和引物之外的PCR反应组分，如DNA聚合酶、扩增缓冲液以及dNTP等试剂为分开独立包装，在使用时需要将上述组分分别加入PCR扩增体系中。这种分步加样型PCR扩增试剂，在使用时增加了加样次数，同时也提高了交叉污染的出现概率。通常使用的PCR扩增体系为10μL、25μL或50μL等微量体系，DNA聚合酶等试剂的加入量也通常只有几微升，在这种微量体系中，上述分步加样型的PCR试剂在使用时也就容易出现因取样不准而导致的重复性差甚至是PCR扩增失败等问题。也有一些实验人员为了减少加样次数或提高扩增反应的重复性，将DNA聚合酶、扩增缓冲液和dNTP简单混合在一起作为母液，然而这种简单的混合物不稳定、不耐冻融、不利于保存，也会导致扩增实验结果不准确甚至实验失败。综上所述，开发出一种适用于高GC含量核酸模板的直用型PCR扩增混合试剂，将除了特异性模板和引物之外的其余PCR组分混合其中，并保持DNA聚合酶的稳定性，有效地减少加样次数，简化试验流程，节约实验时间；并且降低交叉污染和加样错误的风险，提高实验成功率和重复性，是PCR扩增试剂的科学研发与实际应用中亟待解决的问题。
技术实现思路
术语：除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同意义。本专利技术中的术语“dNTPs”指dATP、dGTP、dTTP和dCTP四种单脱氧核糖核苷酸的混合物；术语“ddH2O”指双蒸水；术语“Tris-HCl”指三羟甲基氨基甲烷盐酸盐；本专利技术中的术语“2×”指该溶液中各组分的浓度为其工作浓度的2倍；术语“1×”指该溶液中各组分的浓度为其工作浓度。本专利技术要解决的一个问题是提供一种相对更为高效、灵敏、稳定和灵活的适用于高GC含量核酸的直用型PCR扩增混合试剂。为解决上述问题，本专利技术具体技术方案是，一种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂：2×PCR Taq Mix，所述直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂包括：DNA聚合酶、KCl、Tris-HCl、MgCl2、dNTPs和甘油，溶剂为ddH2O。上述PCR扩增混合试剂中，DNA聚合酶为嗜热性细菌Thermus aquaticus来源的热稳定重组型Taq DNA聚合酶，分子量为94KD。Taq DNA聚合酶的浓度为0.1～0.4U/μL，优选为0.15～0.3U/μL；进一步优选为0.18～0.24U/μL；更进一步优选为0.2U/μL。上述PCR扩增混合试剂中，KCl的浓度为50～150mM；优选为70～120mM；进一步优选为80～110mM；更进一步优选为100mM。上述PCR扩增混合试剂中，Tris-HCl的浓度为10～30mM；优选为15～25mM；进一步优选为18～22mM；更进一步优选为20mM。上述PCR扩增混合试剂中，MgCl2的浓度为1～5mM；优选为2～4.5mM；进一步优选为2.5～3.5mM；更进一步优选为3mM。上述PCR扩增混合试剂中，dNTPs的浓度为200～600μM；优选为300～500μM；进一步优选为350～450μM；更进一步优选为400μM。上述PCR扩增混合试剂中，甘油的体积浓度为5～20％；优选为6～16％；进一步优选为8～14％；更进一步优选为10％。如未另行指出，本文中涉及的甘油浓度均为体积浓度。在某些优选的实施方案中，所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂中还包括增强剂，所述的增强剂为DMSO、NH4Cl、7H2O·MgSO4、甜菜碱、昆布氨酸、龙虾肌碱、乙二醇和山梨醇中的一种或多种。所述的DMSO的体积浓度为0.5～4％；优选为1～3％；进一步优选为1.5～2.5％；更进一步优选为2％。如未另行指出，本文中涉及的甘油浓度均为体积浓度。所述的NH4Cl的浓度为5～18mM；优选为6～14mM；进一步优选为8～12mM；更进一步优选为10mM。所述的7H2O·MgSO4的浓度为1～5mM；优选为2～4mM；进一步优选为2.5～3.5mM；更进一步优选为3mM。所述的甜菜碱的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂2×PCR Taq Mix，其特征在于：所述的混合试剂包括：DNA聚合酶、KCl、Tris‑HCl、MgCl2、dNTPs和甘油，溶剂为ddH2O。
【技术特征摘要】
1.一种直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂2×PCR Taq Mix，其特征在于：所述的混合试剂包括：DNA聚合酶、KCl、Tris-HCl、MgCl2、dNTPs和甘油，溶剂为ddH2O。2.如权利要求1所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂，其特征在于：所述的DNA聚合酶为嗜热性细菌Thermus aquaticus来源的热稳定重组型Taq DNA聚合酶，分子量为94KD。3.如权利要求2所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂，其特征在于：所述的混合试剂包括：Taq DNA聚合酶0.1～0.4U/μL、KCl 50～150mM、Tris-HCl 10～30mM、MgCl2 1～5mM、dNTPs 200～600μM和甘油5～20％，溶剂为ddH2O。4.如权利要求3所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂，其特征在于：所述的混合试剂包括：Taq DNA聚合酶0.15～0.3U/μL、KCl 70～120mM、Tris-HCl 15～25mM、MgCl2 2～4.5mM、dNTPs 300～500μM和甘油6～16％，溶剂为ddH2O。5.如权利要求4所述的直用型高GC含量核酸PCR扩增混合试剂，其特征在于：所述的混合试剂包括：Taq DNA聚合酶0.18～0.24U/μL、KCl 80～...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘翠，刘涛，
申请(专利权)人：青岛海大蓝科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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