一种食品中常见李斯特菌的细菌数值鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种食品中常见李斯特菌的细菌数值鉴定方法。1.本方法所涉及到的生化反应与目前市场上常见的数值鉴定系统的生化反应不同，结合不同李斯特菌的特异性基因进行验证，优化和确证了本方法的可行性和确信度。2.作为细菌数值鉴定法中最为关键的部分，该方法中菌株对不同生化试验的阳性反应率数据库(data)是通过对全国各地分离到的近2000株菌株进行生化反应后得到的，符合该菌属在中国的实际情况。3.对部分MID‑67鉴定结果不好但分子方法可鉴定出来的菌株，通过本方法可以得到较好的鉴定结果，鉴定百分比可以达到90％以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物鉴定领域，具体涉及一种食品中常见李斯特菌的细菌数值鉴定方法。
技术介绍
：随着国内外人民物质生活水平的不断提高，食品安全问题已成为全人类关注的焦点。物理因素、化学因素、生物因素是引起食品安全的三大因素，其中食源性致病微生物尤为关键。美国CDC发布数据表明，1998-2008年间95％食源性中毒事件由食源性致病微生物引起；据中国CDC统计表明，2005-2011年由微生物引起的食物中毒比例占74％。食品安全是关乎国计民生的头等大事，我国当前食品安全形势依然十分严峻，食品中毒事件频频发生，所造成的损失和负面影响巨大。就检测手段而言，目前国家现行的许多检测方法都是非常耗时的经典微生物学方法，加之一味照搬国外模式，建立我国新型快速检测体系相当必要。细菌数值鉴定法是将数学统计学的原理运用到细菌的鉴定实验中，通过比较待测菌株与细菌数据库中已知菌株的生化反应的符合概率，迅速得到鉴定结果。这种方法快速、鉴定率高，可实现自动化和商品化，与双岐索引法和诊断表法并称为三大传统细菌鉴定方法。细菌数值鉴定法最初的理论来源于数值分类法，但这种方法只适合对大量菌株进行分类，对于单个菌株的鉴定却不适用。同时，也有另一种数值分类的方法可以对细菌进行鉴定，这种方法将分支图(Key)引入细菌分类，通过建立数学模型来决定最好的试验，然后菌株通过常规方法得到试验结果，再进行比较鉴定(Annali di Microbiologia edEnzimologia,1958,8(23):1-239.)，相对于传统的方法，这种方法可以节省一些力气，但跟传统的方法相比，也一样不能解决由于一个或多个特征变异所带来的鉴别困难。此时，Lockhart等在1962年提出的概率鉴定法引起了一些学者的兴趣，这种方法是通过对每一个细菌条目的阳性结果与实际的已知的结果进行比对从而得到可靠的鉴定(Journal ofGeneral Microbiology，1962，28,633-640)。Payne(1963)接受了这一方法并与Dybowski和Franklin一起制定了一个详细的概率计算方法并应用与肠杆科的鉴定中(World MedicalElectronics,1963,2:6-11.；Journal of General Microbiology,1968,54(2):215-229)；此后，Lapage等人在1973年通过该方法对1079株革兰氏阴性菌株进行了鉴定，发酵菌株和非发酵菌株的符合率达到了90.8％和82.1％，并正式建立了Lapage细菌数值鉴定理论(Journal of General Microbiology,1973,77(2):273-290)。基于这一理论，法国生物-梅里埃公司又提出了T值、R值和鉴定百分数的评价标准(API，1977)，进一步完善了该理论。Lapage数值鉴定理论的数据方法是基于计算机辅助鉴定下的贝叶斯理论，首先假设每一个细菌条目所进行的生化反应都是独立的，这样每一个细菌条目所出现的概率值也是相对独立的个体。通过不同细菌条目(Taxon)下进行的生化试验(Text)所出现的阳性或者阴性的结果，转换成概率值，再计算得到试验组合ti各个细菌条目下出现概率值，从而得到鉴定分数(ID，identification Scores)。结合计算机技术，将此方法编码成配套软件，结合试验单元，可形成细菌数值鉴定系统。国外在此方面的研究较早，先后开发出如：API(BioMerieux)，Cobas IDA(Roche)，Enterotube II(Roche)，Micro-ID(REMEL)，Spectrum 10(Austin Biological)，Rap ID(Innovative Diag.)，Microbact(Microgen)，Raplianalyzer(Oxoid)，BBLCrystal(BD)等一系列以生化鉴定为主的细菌数值鉴定系统。这些鉴定系统，都表现出了较高的专业化在、自动化和智能化水平，其中API是国际公认的标准鉴定系统。在我国，这方面的研究从20世纪90年代后才开始启动，起步相对较晚，如赵卓等人于1994年开发的应用与肠杆菌科和弧菌科的数值鉴定系统(中国卫生检验杂志,1994,3:012.)；赵贵阳研发的肠杆菌科细菌微量快速生化鉴定系统(中国卫生检验杂志,2004,14(2):142-144)；张银旺等开发的肠杆菌科细菌生化鉴定系统(现代检验医学杂志,2007,22(4):9-11)。虽有报道，但目前，这些鉴定系统也只是文献报道，且目前国内市场基本被国外产品所占领，未见全面推广。李斯特菌属(Listeria spp.)为革兰氏阳性菌，兼性厌氧。目前国际上比较公认的主要包括以下几种：单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)、英诺克李斯特菌(Listeria innocua,LIN)、绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii,LIV)、西式李斯特菌(Listeria seeligeri,LS)、威尔氏李斯特菌(Listeria welshimeri,LW)和格式李斯特菌(Listeria grayi,LG)(Int.J.Med.Microbiol.,2007,297(7-8):541-557)，这些李斯特菌，在环境中无处不在，在绝大多数的食品中都能找到。2010年至今，该属又相继报道了10个新种和2个新亚种，但这些新种均分离自工业和淡水，对人体不致病。其中LIV和LM具有致病性，但仅LM对人有致病性，能引起人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症、心内膜炎、流产、脓肿和局部的脓性损伤，造成孕妇流产、死胎等疾病，发病者死亡率可达20％～70％(Microbiological reviews,1991,55(3):476)，被认为是全球四大食源性致病菌之一。目前，LM及其菌属其他种的鉴定和区分主要通过对分离菌落进行形态学、运动型和生化反应来实现。在李斯特菌的数值鉴定上，也有BioMerieux公司开发的API Listeria，REMEL公司的MID-67，Microgen公司开发的Microbact 12L等，这些鉴定系统，都能较好的区分李斯特菌，但是，不可否认，这些鉴定系统的价格都非常昂贵，一般从几万到几十万不等，在国内并不容易推广应用。此外，随着地域限制、物种的进化和新物种的发现，这些细菌数值鉴定系统中的基础数据也存在一定的缺陷，如生化反应阳性率不够准确，生化反应的选择存在一定的局限性等，都将导致鉴定的错误率提升，一定程度上影响了细菌鉴定的准确性，因此，自主开发具有中国特色的李斯特菌快速鉴定系统显得非常重要。
技术实现思路
：本专利技术的目的是利用细菌数值鉴定的原理，提供一种食品中常见李斯特菌，如单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)、英诺克李斯特菌(Listeriainnocua,LIN)、绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii,LIV)、西式李斯特菌(Listeriaseeligeri,LS)、威尔氏李斯特菌(Listeria welshimeri,LW)和格式李斯特菌(Listeriagrayi,LG)的细菌数值本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种食品中常见李斯特菌的细菌数值鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：a、确定李斯特菌包含的种类，所述的李斯特菌包括单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、英诺克李斯特菌(Listeria innocua)、绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii)、西式李斯特菌(Listeria seeligeri)、威尔氏李斯特菌(Listeria welshimeri)和格式李斯特菌(Listeria grayi)以及11个生化反应，所述的11个生化反应包括七叶甘水解反应，甘露醇产酸反应，麦芽糖产酸反应，鼠李糖产酸反应，塔格糖产酸反应，阿拉伯糖醇产酸反应，1‑磷酸葡萄糖产酸反应，核糖产酸反应，木糖产酸反应，甲基甘露醇产酸反应和绵羊血红细胞溶血反应；b、选择步骤a中的11个生化实验作为数值法中所需要的生化反应：c、建立包括单核细胞增生李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西式李斯特菌、威尔氏李斯特菌和格式李斯特菌的李斯特菌属的数据库，确定数值法中计算方法：根据选择的分类单元与生化实验的阳性概率，形成一个概率矩阵；按照细菌概率鉴定理论确定每一分类单元的总出现频率、多项总发生频率、鉴定百分数的计算方法，具体计算公式如下：每一分类单元的总出现频率等于该分类单元对应的每个生化实验的阳性概率的乘积；多项总发生频率等于每一分类单元的总出现频率的总和；鉴定百分数等于每一分类单元的总出现频率除以多项总发生频率再乘以100％，全体鉴定百分数之和应等于100％；d、待测菌株纯培养后，进行步骤a的11种生化实验；e、获得待测菌株的11种生化实验结果后，根据生化反应的阴、阳，按照计算方法对数据库中所有分类单元进行计算，首先将生化实验值转换成概率值，即实验结果为阳性则就是对应生化实验的阳性概率值；若为阴性则100％减去生化实验的阳性概率值，上述结果若是0或100％，则用近似值1％或99％代替，再按照步骤c的计算方法计算每一个分类单元的总出现频率、多项总发生频率、鉴定百分数；f、根据计算结果，对待测菌株鉴定结果进行判定：根据鉴定百分数的大小进行排序，鉴定百分数最高相对应的菌株即为待测菌株所属的分类单元。...

【技术特征摘要】
1.一种食品中常见李斯特菌的细菌数值鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：a、确定李斯特菌包含的种类，所述的李斯特菌包括单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、英诺克李斯特菌(Listeria innocua)、绵羊李斯特菌(Listeriaivanovii)、西式李斯特菌(Listeria seeligeri)、威尔氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)和格式李斯特菌(Listeria grayi)以及11个生化反应，所述的11个生化反应包括七叶甘水解反应，甘露醇产酸反应，麦芽糖产酸反应，鼠李糖产酸反应，塔格糖产酸反应，阿拉伯糖醇产酸反应，1-磷酸葡萄糖产酸反应，核糖产酸反应，木糖产酸反应，甲基甘露醇产酸反应和绵羊血红细胞溶血反应；b、选择步骤a中的11个生化实验作为数值法中所需要的生化反应：c、建立包括单核细胞增生李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西式李斯特菌、威尔氏李斯特菌和格式李斯特菌的李斯特菌属的数据库，确定数值法中计算方法：根据选择的分类单元与生化实验的阳性概率，形成一个概率矩阵；按照细菌概率鉴定理论确定每一分类单元的总出现频率、多项总发生频率、鉴定百分数的计算方法，具体计算公式如下：每一分类单元的总出现频率等于该分类单元对...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴清平，吴诗，叶青华，张菊梅，郭伟鹏，蔡芷荷，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44