本发明专利技术公开了一种人源抗菌肽LL‑37突变体及其应用，通过对抗菌肽LL‑37分子结构进行优化设计，将抗菌肽LL‑37中的1号位亮氨酸、3号位甘氨酸、16号位谷氨酸、26号位天冬氨酸、34号位精氨酸、35号位苏氨酸分别替换成：甘氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、苏氨酸、精氨酸，实验结果证明突变体具有优良的抗菌活性和稳定性；本发明专利技术主要用于（a）抑制细菌、病毒的生长繁殖及肿瘤细胞的增殖；或（b）杀灭细菌、病毒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药
，具体是一种人源抗菌肽LL-37突变体及其应用。
技术介绍
抗菌肽是生物体天然免疫的重要组成成分，自发现以来，由于其分子量低、抗菌谱广，抗菌机制独特而显示了其在医学和农业上潜在的研究价值和应用价值，其研究及应用已成为抗菌生物技术药物领域的研究热点。目前用于开发抗菌肽生物制剂主要是含有生物活性核心区域的内源性抗菌肽，此类多肽用于药品和食品领域，主要存在以下问题：①要解决药效动力学、毒理学、以及潜在的免疫毒性问题；②抗菌肽分子小，容易被蛋白酶降解，其稳定性有待提高；③小分子物质的分离、纯化困难；④抗菌肽的天然资源有限，依靠化学合成抗菌肽成本较高，而通过基因工程在微生物体内直接表达基因，要解决提高抗菌肽生产效率、降低成本等问题；⑤与传统的抗生素相比，抗菌肽的抗菌活性还不够理想，需要对抗菌肽做改良设计以提高其抗菌活性。抗菌肽LL-37是来源于人的一种α-螺旋型阳离子抗菌肽，它具有广谱抗菌活性，可以抗多种革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌，而且还可通过免疫调节、促进创伤修复、诱导血管生成等，是人体固有免疫防御系统的重要组成部分。文献《The lipid Apalmitoyltransferase PagP: molecular mechanisms and role in bacterialpathogenesis》和《Biofilms formed by gram-negative bacteria undergo increasedlipid a palmitoylation, enhancing in vivo survival》中指出革兰氏阴性菌细胞外膜的棕榈酰转移酶PagP被激活后通过对脂质A酰化，修复细菌外膜通透性从而产生对抗菌肽的抗性。目前，抗生素滥用导致的药物残留和细菌耐药等问题越来越受到人们的重视，细菌对传统抗生素产生耐药性已成为亟待解决的全球性问题。因此，通过抑制脂质A酰化这一途径，研发新的抗菌药物，是本专利技术课题研究的重要内容。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对细菌耐药性的问题，对抗菌肽LL-37进行优化设计，提供一种抗菌活性更好、稳定性高的抗菌肽LL-37的突变体及其应用。本专利技术的一种人源抗菌肽LL-37突变体，所述序列中第一个氨基酸为甘氨酸（G），第三个氨基酸为亮氨酸（L），第十六个氨基酸为谷氨酰胺（Q），第二十六个氨基酸为赖氨酸（K），第三十四个氨基酸为苏氨酸（T），第三十五个氨基酸为精氨酸（R），其它氨基酸残基序列不变。本专利技术的一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码的多肽与人源抗菌肽LL-37相比，人源抗菌肽LL-37中的1号位亮氨酸、3号位甘氨酸、16号位谷氨酸、26号位天冬氨酸、34号位精氨酸、35号位苏氨酸被分别替换成：甘氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、苏氨酸、精氨酸。本专利技术的一种载体，所述载体中含有上述的多核苷酸。本专利技术的一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞中含有上述载体。本专利技术的一种人源抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法，包括以下步骤：（1）利用蛋白质在线分析工具ExPasy、序列对比软件MEGA software、蛋白质分析软件Antheprot、分子对接软件autodock和动力学模拟软件ADF2014 (Amsterdam DensityFunctional)对抗菌肽LL-37的核酸序列进行分析，为抗菌肽LL-37突变体设计提供理论基础；（2）在抗菌肽LL-37突变体的两端引入限制性酶切位点，通过酶切操作连接到酵母表达载体上；（3）将表达载体转化导入GS115酵母菌中，经提取后鉴定得到重组基因工程菌；（4）重组基因工程菌经诱导表达后离心分离收集上清液，经分离纯化获得重组抗菌肽LL-37突变体蛋白。本专利技术中所述抗菌肽LL-37突变体基因前端加上组氨酸标签并引入限制性内切酶EcoR的酶切位点，后端加上一个终止密码子并引入限制性内切酶XbaI的酶切位点。本专利技术中所述载体为pPICZαA。本专利技术中所述酵母菌为毕赤酵母。本专利技术中所述分离纯化方法为现有技术盐析、沉淀、液相层析技术和透析的结合。本专利技术所述的突变体用于（a）抑制细菌、病毒的生长繁殖及肿瘤细胞的增殖；或（b）杀灭细菌、病毒。本专利技术是基于抗菌肽LL-37不同长度的水解片段具有较好的生物学活性，以革兰阴性菌细胞膜棕榈酰转移酶PagP的耐药机制为基础，阳离子抗菌肽通过细菌PhoP-PhoQ 调节系统调控调控细胞膜棕榈酰转移酶PagP表达与活性，促进脂质A酰化，进而影响阳离子抗菌肽与细菌细胞膜的结合，抑制抗菌肽活性。以该途径为突破口，结合α-螺旋型阳离子抗菌肽两亲性、α-螺旋程度等因素对抗菌肽LL-37 的氨基酸残基进行替换、增减等方式，重新设计，获得突变体的氨基酸序列和核苷酸序列。选取大肠埃希菌Escherichia coli (strain K12)细胞细胞膜棕榈酰转移酶PagP作为受体，参见附图1，以抗菌肽LL-37及其氨基酸残基为配体，参见附图2，进行分子对接和动力学模拟。选取抗菌肽LL-37 5位苯丙氨酸到32位缬氨酸中间部位的氨基酸片段作为配体，受体选取棕榈酰转移酶PagP外膜外侧。使用AutoDock对抗菌肽LL-37片段与棕榈酰转移酶PagP进行分子对接，设定格点空间大小为60*60*60 Å3，坐标为（7.063，32.452，49.199），采用拉马克遗传算法对接。通过对接发现抗菌肽LL-37与棕榈酰转移酶PagP的结合位点，参见附图3，包括抗菌肽LL-37中的GLU11，LEU28、LYS12、PHE27、ILE13和PHE6，棕榈酰转移酶PagP中的ARG94，TRP89，ASN65，SER3，GLU90、GLU90，ASN100、HIS102和THR92。重复多次对接后确定最好的对接构象，对应的配体效率值见表1。从上表1可以看出，8种LL-37片段作为配体与受体对接时，配体效率从-1.6100~ -2.2389Kcal/mol，为后续LL-37突变体的设计奠定了实验基础。利用ADF2014 (Amsterdam Density Functional)软件，采用ReaxFF方法，首先对抗菌肽LL-37和棕榈酰转移酶PagP进行优化，获得最小能量结构下的原子位置和晶格参数。然后，设定ReaxFF模拟参数与条件，在100*100*100 Å3的周期性空间内，采用随机均匀的方式放入4个抗菌肽LL-37分子和1个棕榈酰转移酶PagP分子，温度设定为室温298K，采用Velocity Verlet（NVT）系综，进行0皮秒内的内部压力弛豫分析，使温度和压力在预定值附近波动，经过不同时间节点，分析体系构象。在对产物的识别分析中，为研究分子的性质，采用密度泛函理论（使用PBE-D3(BJ)泛函，TZ2P基组）计算分子间键能。ReaxFF方法模拟表明：在0皮秒时，体系呈周期性地随机分布于单元为100*100*100 Å3的空间内，分子之间的最短距离不小于2.5埃。体系经过8.75 皮秒时，由于LL-37与棕榈酰转移酶PagP的疏水基团互相融合发生接触，参见图4，其中球形原子为LL-37与PagP发生接触的原子，结构图中红色、蓝色、白色、灰色小球分别表示O、N、H、C原子，左边区域来自本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人源抗菌肽LL‑37突变体，其特征在于：所述序列中第一个氨基酸为甘氨酸（G），第三个氨基酸为亮氨酸（L），第十六个氨基酸为谷氨酰胺（Q），第二十六个氨基酸为赖氨酸（K），第三十四个氨基酸为苏氨酸（T），第三十五个氨基酸为精氨酸（R），其它氨基酸残基序列不变。
【技术特征摘要】
1.一种人源抗菌肽LL-37突变体，其特征在于：所述序列中第一个氨基酸为甘氨酸（G），第三个氨基酸为亮氨酸（L），第十六个氨基酸为谷氨酰胺（Q），第二十六个氨基酸为赖氨酸（K），第三十四个氨基酸为苏氨酸（T），第三十五个氨基酸为精氨酸（R），其它氨基酸残基序列不变。2.一种分离的多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸编码的多肽与人源抗菌肽LL-37相比，人源抗菌肽LL-37中的1号位亮氨酸、3号位甘氨酸、16号位谷氨酸、26号位天冬氨酸、34号位精氨酸、35号位苏氨酸被分别替换成：甘氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、苏氨酸、精氨酸。3.一种载体，其特征在于：所述载体中含有如权利要求2所述的多核苷酸。4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞中含有如权利要求3所述的载体。5.一种人源抗菌肽LL-37突变体蛋白的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）利用蛋白质在线分析工具ExPasy、序列对比软件MEGA software、蛋白质分析软件Antheprot、分子对接软件autodock和动力学模拟软件ADF2014 (Amsterdam DensityFunctional)对抗菌肽LL-37的序列进行分析，为抗菌肽LL-37突变体设计提供理论基础；（2）以分...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨浩，刘俊，付靖瑜，韩跃武，罗鹏程，汪宏良，
申请(专利权)人：黄石市中心医院，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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