本发明专利技术公开了一种大鼠体外受精营养液RTF(Rat Tube Fluid)及其在培养大鼠受精卵中的应用。本发明专利技术根据钠离子和钙离子在动物精卵结合中的特殊作用，结合大鼠精卵结合的特殊需求，提出了一种大鼠体外受精营养液。本发明专利技术的大鼠体外受精营养液使得大鼠的人工辅助生殖得以进行，能够实现保存品系后代的同时又实现了微生物学的净化。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属动物学实验动物学综合领域，具体涉及大鼠精子和卵子体外受精营养液(RTF)及其应用。
技术介绍
大鼠是非常重要的实验动物，其使用量仅次于小鼠，但由于其本身的特殊性，大鼠的体外受精一直比较困难，生物试剂市场上也没有大鼠专用体外受精液，人们常用的体外受精液一般为人的体外受精液如IVF-20或IVF-30，由于人与大鼠的差异性，使用人的体外受精液进行大鼠的体外受精，往往受精率和发育率较低，无法获得足够数量的大鼠胚胎进行转移。人的体外受精液是在人输卵管液(HTF)成分的基础上配制而成的，成分配比请见表1。表1HTF培养液成分(Human Tube Fluid)成分 浓度(毫摩尔/升 浓度(克/升 氯化钠 101.6 氯化钾 4.69 磷酸二氢钾 0.37 硫酸镁 0.2 乳酸钠 21.4 丙酮酸钠 0.33 葡萄糖 2.78 碳酸氢钠 25.0 氯化钙 2.04 牛血清白蛋白 4.0 目前因为没有市场供应的RTF，很多实验室在大鼠疾病模型制备后不能快速地繁殖成群进行科学研究，一旦转基因或基因敲除大鼠发生生殖器官障碍，也不能利用体外受精的方式保留后代，只能任其绝种，种质资源无法保存。当稀有品系的大鼠面临死亡或生殖器官缺陷时，人们往往对其进行施救，希望在保存其生命的情况下，恢复其生殖功能，然后进行剖腹产或胚胎移植进行保存该品系，但施救不成功或生殖功能不能恢复的情况下，只能任由该品系模型大鼠丢失。
技术实现思路
为了克服现有技术中的上述缺陷，本专利技术提出了一种大鼠体外受精营养液RTF(Rat Tube Fluid)及其在培养大鼠受精卵中的应用。本专利技术根据钠离子和钙离子在动物精卵结合中的特殊作用，结合大鼠精卵结合的特殊需求，提出了一种大鼠体外受精营养液。本专利技术提供了一种大鼠体外受精营养液包括：氯化钠101.6mmol/L，氯化钾4.69mmol/L，磷酸二氢钾0.37mmol/L，硫酸镁0.2mmol/L，乳酸钠15‐19.5mmol/L，丙酮酸钠0.335‐0.345mmol/L，葡萄糖2.78mmol/L，碳酸氢钠25.0mmol/L，氯化钙3.0‐6.0mmol/L，牛血清白蛋白4.0g/L。溶剂为双蒸水。优选地，本专利技术的大鼠体外受精营养液包括：氯化钠101.6mmol/L，氯化钾4.69mmol/L，磷酸二氢钾0.37mmol/L，硫酸镁0.2mmol/L，乳酸钠17-19mmol/L，丙酮酸钠0.34-0.345mmol/L，葡萄糖2.78mmol/L，碳酸氢钠25.0mmol/L，氯化钙4.0-6.0mmol/L，牛血清白蛋白4.0g/L。溶剂为双蒸水。进一步优选地，本专利技术的大鼠体外受精营养液包括：氯化钠101.6mmol/L，氯化钾4.69mmol/L，磷酸二氢钾0.37mmol/L，硫酸镁0.2mmol/L，乳酸钠18mmol/L，丙酮酸钠0.34mmol/L，葡萄糖2.78mmol/L，碳酸氢钠25.0mmol/L，氯化钙5.0mmol/L，牛血清白蛋白4.0g/L。溶剂为双蒸水。本专利技术还提出了将所述大鼠体外受精营养液用于大鼠体外受精卵的培养的应用。本专利技术的有益效果在于：由于大鼠在人类疾病模型制备中的重要作用，大鼠的人工辅助生殖技术成为大鼠的人类疾病模型种群扩繁和种质资源保存的瓶颈，而体外受精是人工辅助生殖的突破点，大鼠体外受精营养液的应用可以使得大鼠的体外受精得以顺利进行，在自然交配无法获得大鼠资源或自然繁殖扩群速度太低的情况下，就可以利用体外受精技术在RTF培养液中完成精子与卵子的结合，获得无菌大鼠胚胎，经过胚胎移植后建立SPF子代种群。突破雄鼠、雌鼠自然交配的瓶颈。为大鼠种质资源保存提供保障。本专利技术的大鼠体外受精营养液使得大鼠的人工辅助生殖得以进行，通过采用体外受精技术，将刚刚死亡的雄性大鼠解剖，取其附睾及输卵管，释放其中的精子，经过处理后进行体外受精后，再进行胚胎移植，最终即保存了该品系的后代又实现了微生物学净化的目的。具体实施方式结合以下具体实施例，对本专利技术作进一步的详细说明。实施本专利技术的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本专利技术没有特别限制内容。以双蒸水为基础液，配制大鼠体外受精营养液，包括：氯化钠101.6mmol/L，氯化钾 4.69mmol/L，磷酸二氢钾0.37mmol/L，硫酸镁0.2mmol/L，乳酸钠15‐19.5mmol/L，丙酮酸钠0.335‐0.345mmol/L，葡萄糖2.78mmol/L，碳酸氢钠25.0mmol/L，氯化钙3.0‐6.0mmol/L，牛血清白蛋白4.0g/L。溶剂为双蒸水，充分混匀后，用0.22微米的病毒滤器过滤，0.5毫升分装后备用，标记为RTF。应用：(1)精子的获得：成年12-14周龄雄性SD大鼠颈椎脱臼处死，无菌取出附睾尾，在附睾尾上用眼科剪剪出3-4个小孔，浸入200ul-400ul预热的37℃体外受精液中，用矿物油覆盖，置于37℃，二氧化碳5％的培养箱中，待精子从附睾尾中游出备用。将游出的精子转移至100ul预热的37℃体外受精液中，调整数量为106-7用矿物油覆盖，置于37℃，二氧化碳5％的培养箱中，放置1-1.5小时。此为精子获能过程。(2)卵子的准备：取5-6周与雄鼠同品系的SPF级雌鼠，实验前3天注射PMSG(孕妈血清激素)30-50IU，48小时后注射HCG(人绒毛膜促性腺激素)25-40IU，14-16小时后，颈椎脱臼处死，打开腹腔，分离输卵管，将卵团挑入100ul-200ul预热的37℃体外受精营养液中，并洗涤2-3次，用矿物油覆盖。置于37℃，二氧化碳5％的培养箱中。(3)受精过程：取步骤(1)获能的精子液10ul置于(2)中的卵团中，置于37℃，二氧化碳5％的培养箱中继续培养，进行受精。(4)受精卵的挑选：6-7小时后，将受精液滴置于显微镜下挑选，选得分散的卵子，移入矿物油覆盖的100ul预热至37℃的RM1ECM培养液中，继续培养20-22小时后，挑选发育至2-4细胞期胚胎，并计算受精发育率。实施例1～4配置不同组分大鼠体外受精营养液，分别标记为A、B、C、D备用，见表1所示，表1实施例1～4的RTF培养液成分(1)精子的获得：成年12-14周龄雄性SD大鼠颈椎脱臼处死，无菌取出附睾尾，在附睾尾上用眼科剪剪出3-4个小孔，浸入200ul-400ul预热的37℃体外受精液中，用矿物油覆盖，置于37℃，二氧化碳5％的培养箱中，待精子从附睾尾中游出备用。将游出的精子转移至100ul预热的37℃体外受精液中，调整数量为106-7用矿物油覆盖，置于37℃，二氧化碳5％的培养箱中，放置1-1.5小时。此为精子获能过程。(2)卵子的准备：取5-6周与雄鼠同品系的SPF级雌鼠，将雌鼠分为5组，每组5只，实验前3天注射PMSG(孕妈血清激素)30-50IU，48小时后注射HCG(人绒毛膜促性腺激素)25-40IU，14-16小时后，颈椎脱臼处死，打开腹腔，分离输卵管，将卵团挑入100ul-200ul预热的37℃体外受精液中，对照组使用HTF受精液，实验组分别使用A、B、C、D受精液，并用各本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种大鼠体外受精营养液，其特征在于，氯化钠101.6mmol/L，氯化钾4.69mmol/L，磷酸二氢钾0.37mmol/L，硫酸镁0.2mmol/L，乳酸钠15‑19.5mmol/L，丙酮酸钠0.335‑0.345mmol/L，葡萄糖2.78mmol/L，碳酸氢钠25.0mmol/L，氯化钙3.0‑6.0mmol/L，牛血清白蛋白4.0g/L，溶剂为双蒸水。
【技术特征摘要】
1.一种大鼠体外受精营养液，其特征在于，氯化钠101.6mmol/L，氯化钾4.69mmol/L，磷酸二氢钾0.37mmol/L，硫酸镁0.2mmol/L，乳酸钠15-19.5mmol/L，丙酮酸钠0.335-0.345mmol/L，葡萄糖2.78mmol/L，碳酸氢钠25.0mmol/L，氯化钙3.0-6.0mmol/L，牛血清白蛋白4.0g/L，溶剂为双蒸水。2.如权利要求1所述的大鼠体外受精营养液，其特征在于，氯化钠101.6mmol/L，氯化钾4.69mmol/L，磷酸二氢钾0.37mmol/L，硫酸镁0.2mmol/L，乳酸钠17-19mmol/L，丙酮酸钠0.34-0.345mmol/L，葡萄糖2.78mmol...
【专利技术属性】
技术研发人员：马雪云，刘腾飞，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。