本发明专利技术属于植物基因工程技术领域。具体涉及褐飞虱为害诱导型水稻启动子的分离及表达模式鉴定。筛选得到一个在水稻绿色组织特异性表达，且表达水平受褐飞虱为害上调的基因。通过PCR的方法从水稻基因组中分离该基因的启动子区域，将这个启动子命名为PTG3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。利用PTG3与GUS报告基因构建融合表达基因，通过农杆菌介导的方法转化水稻中花11。对获得的转基因水稻苗在接种褐飞虱若虫前后的GUS组织化学染色和定量RT-PCR检测，确定PTG3启动子在褐飞虱为害的条件下可以显著提高下游基因的表达水平，该特征在水稻抗虫基因工程育种中具有潜在应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程
具体涉及水稻褐飞虱为害诱导型启动子区域的分离及表达模式鉴定。所述的褐飞虱为害诱导型启动子区域为一个DNA片段，它能够在褐飞虱取食诱导条件下特异性增强基因的表达水平。
技术介绍
植物在生长过程中，会受到多种虫害如褐飞虱、二化螟及粘虫等的侵害。褐飞虱是水稻的主要害虫之一，它刺吸水稻可能导致两种后果：(1)褐飞虱刺吸水稻茎、叶组织韧皮部汁液，导致水稻水份大量丧失，引起稻株瘫痪倒伏，同时褐飞虱还可以作为中间寄主传播病毒病害，严重时水稻会减产甚至失收。(2)水稻对其产生抗虫防御反应(Erd et al.,2012)，产生杀虫物质或毒性蛋白(娄永根等，1997)，杀死害虫或阻止其对水稻进行为害。利用抗性基因资源改良植物的抗虫性，是预防虫害同时又保护环境的根本出路。采用转基因技术将抗性基因导入植物是目前改良农作物抗虫性的主要途径之一。但是目前的基因工程体系存在一些不足，很重要的一点是转化载体中使用的启动子大多是组成型表达启动子，如玉米Ubiquitin启动子和CaMV35S启动子。这不仅给植物体带来代谢负担，使植物在不需要发生抗虫反应时大量表达外源蛋白，造成了浪费；严重的还造成了植物体生理和代谢的紊乱，致其产生变异或死亡(Karlowski et al.,2003；Miyao et al.,2003；Durrant and Dong,2004)。为了解决以上问题，申请人试图使用特异性启动子调控目标基因的表达。启动子是一段对基因表达起调控作用的DNA片段。启动子在原核生物和真核生物中均存在，它是一段对基因转录的时间、空间和表达量起调控作用的DNA序列。在原核和真核生物中，启动子的结构有所不同。真核生物有三种RNA聚合酶，每一种都有其识别的不同启动子。RNA聚合酶II负责蛋白质基因和部分snRNA基因的转录，结构最为复杂。人们比较了上百个聚合酶II识别的真核启动子的序列，发现了一些共同的结构。如1)帽子位点，即转录起始位点，其碱基大多为A，两侧各有若干个嘧啶核苷酸，其中A为转录起点。2)TATA框，又称Hogness框或Goldberg-hogness框，其一致序列为：TATAAAA或TATATAT，而在它的两侧由富含G和C碱基对的序列组成。TATA框决定了转录起始点的选择，它是RNA聚合酶和DNA链结合的部位。3)CAAT框，其一致序列为GGC(T)CAATCT。该框的碱基一旦缺失或突变，将会造成转录效率的急剧降低，CAAT框可能控制着转录起始的频率。4)增强子(enhancer)，又称为远上游序列，一般都在-100bp以上，它对依赖和不依赖TATA框的转录均有增强转录的作用。另外，不同的启动子上还有其他不同的顺式(cis)调控元件，它们是反式(trans)调控因子或转录调控蛋白的结合位点。不同的反式调控因子/转录调控蛋白特异性的与顺式调控元件结合，对基因的表达时间，空间或表达量进行特异性的调控。特异性的启动子一般分为两类，一类是受诱导表达的特异启动子，称之为诱导型启动子，另一类是组
织特异性表达的启动子，称之为组织特异型启动子。诱导型的启动子对外界的某些物质，如虫害、病原物、化学物质或逆境作出反应，启动植物体内相应的基因表达。组织特异型的启动子则驱动基因在特定的组织中表达。特异性的启动子可避免基因过量表达对植物体产生伤害。因此，利用水稻来源的褐飞虱取食诱导表达的启动子驱动抗性基因的表达，是改良水稻抗虫性的最佳选择之一。
技术实现思路
本专利技术目的是克隆一个水稻基因Os01g73940启动子PTG3的DNA片段，对水稻中分离克隆的褐飞虱抗性启动子PTG3区段进行功能验证，该片段包含对褐飞虱产生应答反应的元件，探索利用这个启动子调控抗性基因的表达，从而改良水稻的抗虫性。根据本申请人所在的作物遗传改良国家重点实验室褐飞虱取食水稻的全基因组表达芯片数据及水稻品种明恢63和珍汕97全基因组全生育期表达谱芯片数据，挑选出一个主要在绿色组织表达，在胚乳中不表达或者表达量低，并且受褐飞虱取食诱导表达上调的基因Os01g73940。通过比较在褐飞虱高抗水稻品种RH和褐飞虱敏感水稻品种TN1中诱导后基因的表达情况，找出褐飞虱为害诱导特异性表达的基因。确定该基因的第一个起始密码子ATG，针对其上游2Kb左右的区间设计引物，选择褐飞虱取食后在RH和TN1中基因表达上调倍数较高的水稻品种的基因组作为模板，克隆该基因启动子片段并命名为PTG3。将PTG3构建到启动子验证载体DX2181b(图1)上，形成终载体DX2181b-PTG3(图2)。通过农杆菌介导法将DX2181b-PTG3导入粳稻品种中花11，对获得的转基因苗接种褐飞虱若虫，并对GUS组织化学染色和表达量进行检测，确定PTG3启动子的表达模式。在褐飞虱为害后，转基因植株中GUS表达水平上调明显，证明该启动子片段确实为一个褐飞虱诱导型启动子。在本专利技术的实施例部分，申请人阐述了验证PTG3启动子的分离过程以及其功能特点。附图说明序列表SEQ ID NO：1是本专利技术分离PTG3启动子的核苷酸序列。图1：是本专利技术应用的启动子验证载体DX2181b结构示意图。图2：是本专利技术制备的重组表达载体DX2181b-PTG3的T-DNA插入区的结构示意图。图3：载体pEASY-T3vector结构示意图图4：PTG3转基因植株在褐飞虱为害和JA处理24h后GUS报告基因转录水平检测。附图标记说明：图4中的A)图是转基因植株接种褐飞虱若虫24h后的形态；图4中的B)图是转基因植株经过茉莉酸(JA)处理24h后的形态。图5：是PTG3转基因植株在褐飞虱为害和经过JA处理24h后的GUS化学组织染色检测结果。具体实施方式本专利技术的前期研究工作结果显示在褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal)取食水稻的条件下，可特异性的诱导水稻内源基因Os01g73940的表达。前期研究还发现，该基因启动子上含有与水稻转录因子WRKY71的结合位点WRKY710S，推测在水稻对病原微生物的防卫反应中起重要作用。以下实施例进一步定义本专利技术，并描述了本专利技术在上述前期研究工作结果的基础上验证TG3启动子(PTG3)功能的方法和结果。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本专利技术的基本特征，并且在不偏离本专利技术精神和范围的情况下，对本专利技术做出各种修改，以使其适用各种用途和条件。实施例1：PTG3启动子的结构分析采用启动子分析软件TSSP(http://www.softberry.com)，PROSCAN(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/proscan)，PLACE(A Database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements)中的Signal Scan分析工具(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)，TESS(http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/gene-search.html)，Match 1.0(http://www.gene-r本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种受褐飞虱为害诱导的启动子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种受褐飞虱为害诱导的启动子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。2.一种在褐飞虱为害条件下，提高外源基因在转基因水稻中表达水平的方法，其特征在于，利用序列表SEQ ID NO：1所示的启动子，与外源基...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈浩，关丽梅，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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