本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种用于检测与AML预后相关的基因突变的引物组合、含有该引物组合的试剂盒以及检测与AML预后相关的基因突变的方法。本发明专利技术的引物组合覆盖了FLT3、NPM1、DNMT3A和CEBPA基因全部热点突变位点，特异性强、覆盖面广。同时，本发明专利技术设计的全部引物的退火温度均在相近水平，扩增阶段可使用同一程序一次完成，对热点突变可进行联合并行检测，检测效率高。此外，本发明专利技术采用正反向扩增引物直接进行测序，通过软件直接进行突变的分析，检测直观、成本低，为急性髓细胞白血病的治疗方案确定及预后判断提供了重要的参考依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及用于检测与AML预后相关的基因突变的引物、试剂盒及方法。
技术介绍
急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一组起源于造血干细胞的恶性血液病，具有高度异质性。目前，在AML评价预后危险度的众多因素中，细胞遗传学被认为是重要的独立预后因素，一些特异性染色体核型异常，常被认为是指导治疗和判断预后的标志。但仍有相当一部分患者检测不到核型异常，这些患者无论是在治疗反应还是预后评价上都存在较大的变异。由于分子生物学技术的迅速发展，陆续鉴定出多个与AML相关的分子标志物，这也充分证明了基因改变是AML发病的重要基础。其中FLT3-ITD、NPM1和CEBPA基因突变已经作为重要的危险分层评价指标，纳入2010年急性髓细胞白细胞NCCN指南中。FLT3发生基因突变将破坏正常血细胞的增值、分化和凋亡，甚至在某些情况下能够单独或与其他细胞因子组合，为白血病细胞增值提供支持，是骨髓恶性肿瘤的重要驱动型突变。其突变类型主要有两种形式：一种是近膜区的内部串联重复(ITD)突变，常发生于外显子14或15；另一种是活化环D835的点突变，常发生于外显子20。FLT3-ITD在AML中的发生率约为14％-32％，出现于FAB各亚型，其中以M5最多见。国内外研究显示伴有FLT3-ITD阳性的患者常伴有高外周血白细胞数，高骨髓原始细胞比例，还表现为较低的CR率、DFS、EFS和OS，具有独立的不良预后意义。而D835点突变的发生率仅为7％左右，与白血病的预后相关性存在争议，有待进一步深入验证。NPM1基因在12号外显子上发生插入突变，改变NPM1蛋白C末端的密码子，在成人急性髓细胞白血病患者中表达高达35％左右，亚洲人少于欧美，是AML中发现的占比率最高的突变，研究发现NPM1基因 突变的发生率在FAB各亚型中亦具有异质性，见于除M3外的各亚型。尽管NPM1突变的类型不一，但均属于移码突变，导致核定位信号异常，从而使核磷蛋白由核内易位于胞质，该异常定位不但可以影响蛋白质的正常功能，同时对某些肿瘤抑制基因ARF、P53的正常通路及功能也会产生一定的影响。NPMl基因突变是AML预后相对较好的判断指标。具有NPM1突变的正常核型AML患者CR率较高，EFS、DFS、OS时间也明显延长，这可能与NPM1突变患者对化疗药物较敏感有关。在不伴有FLT3-ITD突变的患者中，NPM1突变阳性患者具有良好的预后。DNMT3A突变在急性髓细胞白血病患者中发生率高达20％～30％，且DNMT3A阳性对AML的治疗与预后，尤其是对正常核型的患者有重要指导意义。经国内外大宗实验证明，突变大多集中于外显子23号，编码第882位精氨酸的基因位点的错义突变，但其在外显子11～22内发生的突变类型多样。作为在AML患者中发生率仅次于FLT3与NPM1的突变类型，不同于其他两种突变在AML中的高危影响，DNMT3A突变在患者处于长期完全缓解状态下，仍可能保持阳性。但DNMT3A所导致的甲基化异常，影响表观遗传学调节，与AML的发生密切相关，是近年来白血病治疗的靶点之一，对临床医师选择药物或干细胞移植具有指导作用。CEBPA基因突变见于约5％～15％的AML患者，以M1、M2亚型居多。其突变主要有两种形式:一是N-端的移码突变，导致正常p42蛋白翻译提前终止，从另一个起始密码子开始翻译成截短的p30蛋白；二是C-端发生的碱基插入、缺失、重复和替换，通常为框内突变，产生的蛋白缺乏DNA结合及同源二聚体活性。患者既可发生单突变(CEBPA single mutation，CEBPAsm)，也可发生双突变(CEBPA double mutation，CEBPAdm)。因此，CEBPA基因若发生突变，其编码的C/EBPα蛋白结构或表达异常将导致粒系分化障碍、不成熟粒系前体细胞异常增殖，甚至引起急性髓细胞白血病的发生。目前，越来越多的研究显示只有伴有CEBPAdm的AML患者才具有良好的预后，CEBPAdm患者CR率优于CEBPAsm和CEBPA野生型患者，多因素分析显示伴有CEBPAdm的AML患者OS、EFS及RFS均较高，对其进行精确筛查有助于临床医师为患者选择最佳的治疗方案。在当前国内外广泛使用的分子生物学检测白血病基因突变方法中，荧光原位杂交技术(FISH)只能进行定性检测、操作复杂；荧光定量PCR存 在着检测通量的局限性，对于CEBPA与NMP1等没有明确突变热点的情形，需要设计多对引物及探针，成本高且存在漏检的可能性，所以都还不能真正满足临床诊断检测的需要。因此，目前亟需一种特异性强、快速、成本低、漏检率低的检测与AML预后相关基因突变的方法，该方法能够真正满足临床诊断检测的需求。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的上述缺陷，基于Genbank公布的最新的与AML预后相关的各突变基因的序列，重新设计了覆盖FLT3、NPM1、DNMT3A和CEBPA基因全部热点突变位点的引物以及对FLT3、NPM1、DNMT3A和CEBPA基因突变进行联合并行检测的方法。为此，本专利技术一方面提供了一种用于检测与AML预后相关的基因突变的引物组合，其由SEQ ID NO.1-34所示的引物组成。在本专利技术优选的实施方案中，本专利技术的引物组合进一步由第1-4组引物组成，其中第1组由SEQ ID NO.1-4所示的引物组成，第2组由SEQ ID NO.5-6所示的引物组成，第3组由SEQ ID NO.7-26所示的引物组成，第4组由SEQ ID NO.27-34所示的引物组成。在本专利技术进一步优选的实施方案中，本专利技术在进行PCR扩增时，每条引物的浓度优选为5μM；在进行测序反应时，每条引物的浓度优选为3.2μM。本专利技术另一方面提供了一种用于检测与AML预后相关的基因突变的试剂盒，其包含本专利技术所述的引物组合。在本专利技术优选的实施方案中，本专利技术在进行PCR扩增时，每条引物的浓度优选为5μM；在进行测序反应时，每条引物的浓度优选为3.2μM。本专利技术另一方面提供了本专利技术的引物组合在制备用于检测与AML预后相关的基因突变的试剂盒中的应用。本专利技术再一方面提供了本专利技术所述的引物组合，或者本专利技术所述的试剂盒在检测与AML预后相关的基因突变中的应用。本专利技术最后一方面提供了一种检测与AML预后相关的基因突变的方法，其包含以下步骤：1、获取待测样品DNA；2、采用本专利技术所述的引物组合，或采用本专利技术所述的试剂盒，以步骤1中获取的DNA为模板，进行PCR扩增；3、PCR扩增产物经电泳鉴定后，进行测序反应；4、测序反应产物经纯化、变性后，上测序仪测序；5、对测序峰图进行分析，对与AML预后相关的基因突变类型进行识别。在本专利技术优选的实施方案中，本专利技术在进行PCR扩增时，每条引物的浓度优选为5μM；在进行测序反应时，每条引物的浓度优选为3.2μM。在本专利技术进一步优选的实施方案中，本专利技术在进行测序反应之前，采用虾碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatas(Shrimp))和外切酶(Exonuclease I)对步骤2获得的扩增产物进行消化处理，以去除双链DNA之外的杂质。由上述描述可知，与现有技术相比，本专利技术具备如下优点。1、本专利技术基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测与AML预后相关的基因突变的引物组合，其由SEQ ID NO.1‑34所示的引物组成。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测与AML预后相关的基因突变的引物组合，其由SEQ ID NO.1-34所示的引物组成。2.根据权利要求1所述的引物组合，其进一步由第1-4组引物组成，其中第1组由SEQ IDNO.1-4所示的引物组成，第2组由SEQ ID NO.5-6所示的引物组成，第3组由SEQ ID NO.7-26所示的引物组成，第4组由SEQ ID NO.27-34所示的引物组成。3.根据权利要求1或2所述的引物组合，其中在进行PCR扩增时，每条引物的浓度为5μM；在进行测序反应时，每条引物的浓度为3.2μM。4.一种用于检测与AML预后相关的基因突变的试剂盒，其包含权利要求1-3中任一项所述的引物组合。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中在进行PCR扩增时，每条引物的浓度为5μM；在进行测序反应时，每条引物的浓度为3.2μM。6.权利要求1-3中任一项所述的引物组合在制备用于检测与AML预后相关的基因突变的试剂盒中的应用。7.权利要求1-3...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑仲征，杜金伟，安雪茹，郁晓晨，徐郁尚，
申请(专利权)人：上海荻硕贝肯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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