一种用于梨同源转基因功能验证材料的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种用于梨同源转基因功能验证材料的筛选方法，其包括以下步骤：(一)梨再生最适个体筛选：通过对田间性状表现优良的多株梨进行单株采果取种、单株播种以及多轮再生培养方式筛选不定芽再生效果最好的单株作为梨再生最适个体；(二)梨转基因植株获得：在筛选到梨再生最适个体基础上进一步建立高效再生、生根及转基因体系，并通过抗生素筛选获得转基因植株。本发明专利技术的方法操作简单，取材方便，成本较低，适用于所有梨属材料。可以利用现有的通用再生培养基进一步筛选最适的转基因材料并建立高效再生、生根及转基因体系，为梨遗传转化提供技术支持。

【技术实现步骤摘要】
201610242856

【技术保护点】
一种用于梨同源转基因功能验证材料的筛选方法，其包括以下步骤：(1)秋子梨再生最适个体筛选方法A、选择田间性状表现优良的多株秋子梨单株，分别于果实成熟时期采果取种，并对种子进行层积处理；B、将完成层积处理的种子，流水洗净，用2％的次氯酸钠溶液消毒处理10分钟，无菌水冲洗干净后将种子播种于MS+蔗糖30g/L+琼脂6.0‑7.0g/L，PH5.8‑6.0的培养基上；C、待种子萌发至长出6‑8片真叶后，分别将每株实生苗的真叶剪下，剪成5mmX5mm外植体，并于叶脉处横切2‑4个伤口，将叶片正面朝上接种于诱导梨属植物不定芽的通用再生培养基上，在25±2℃条件下暗培养2周，通用再生培养基为NN69+噻苯隆(TDZ)3.0mg/L+吲哚丁酸(IBA)0.3mg/L+蔗糖40g/L+琼脂6.0g/L,PH5.8；D、在步骤C的暗培养结束后转入光下培养，在光下培养过程中观察每株实生苗的外植体愈伤组织和不定芽产生情况，将不定芽产生速度快、数量多、状态好的外植体对应单株作为秋子梨再生的初选单株材料；E、将步骤D中初选材料诱导出的不定芽接种于增殖培养基上，使芽尽快长成健壮的嫩梢，并进行适当增殖；F、对已经进行芽增殖培养的初选材料，再次分别取嫩梢幼叶按照步骤C、步骤D的操作进行不定芽诱导，然后将不定芽产生速度最快、数量最多、状态最好的外植体作为遗传转化的候选单株材料；将候选材料诱导出的不定芽按照步骤E的操作进行芽增殖培养，获得大量候选材料试管苗；(2)秋子梨转基因植株获得方法G、最适再生培养基的筛选：在通用培养基基础上调整激素配比，筛选出最适于秋子梨候选单株材料的再生培养基；H、预培养：选择生长一致的用于遗传转化的试管苗幼叶作为外植体，用无菌刀片垂直于叶片中脉横切2～4个伤口，叶片正面朝上接种于不定芽诱导的再生培养基上，暗环境下预培养5天；I、侵染：将预培养的外植体叶片浸入含转化载体的农杆菌侵染液中10‑30分钟，其中农杆菌菌液OD600＝0.6‑0.8；J、共培养：将吸干水分的外植体叶片继续接种到再生培养基上，黑暗条件下共培养2天；K、脱菌筛选培养：将外植体叶片转接到含10mg/L卡那霉素筛选剂与200mg/L头孢霉素脱菌剂的再生培养基上进行抗性苗筛选，暗培养7天后，转到光下培养，培养温度为25±2℃，将在含卡那霉素的再生培养基上能够正常生长的植株初步确定为转基因抗性植株；L、生根培养：待转基因抗性植株长到2.5‑3.5cm时，将其转接到含5mg/L卡那霉素筛选剂的生根培养基上进行生根培养，将能够在含卡那霉素培养基上生根的植株确定为转基因阳性植株，生根培养基为1/2MS+吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L,pH值为5.8。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王然，杨英杰，李鼎立，张梅，李健楠，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37