【技术实现步骤摘要】
201610159897
【技术保护点】
一种C30类胡萝卜素合酶表达质粒pMK3‑crtmn，是由以下方法构建而成：1.1 C30类胡萝卜素合成酶基因的克隆参照已发表的金黄色葡萄球菌参考菌株基因组序列(GenBank登陆号：NC_007795.1)，设计一对扩增crtm和crtn的引物。此引物扩增的序列包含了位于crtm阅读框上游的启动子部分，并在上、下游引物5端分别引入15个碱基的同源臂序列(下划线为同源臂)，引物序列如下：P1：5’‑TGATTACGCCAAGCTGCATTTGGACCGGTGACATTAACAA‑3’P2：5’‑GAATTCCCGGGGATCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTATACG‑3’以金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)提取的基因组DNA为模板，用合成的P1、P2引物PCR扩增crtm的启动子及crtm和crtn基因，PCR反应体系均为50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 3min，30个循环，72℃ 10min，4℃ 10min。回收扩增产物。1.2 pMK3‑crtmn质粒的构建用限制性内切酶HindIII和...
【技术特征摘要】
1.一种C30类胡萝卜素合酶表达质粒pMK3-crtmn，是由以下方法构建而成：1.1 C30类胡萝卜素合成酶基因的克隆参照已发表的金黄色葡萄球菌参考菌株基因组序列(GenBank登陆号：NC_007795.1)，设计一对扩增crtm和crtn的引物。此引物扩增的序列包含了位于crtm阅读框上游的启动子部分，并在上、下游引物5端分别引入15个碱基的同源臂序列(下划线为同源臂)，引物序列如下：P1：5’-TGATTACGCCAAGCTGCATTTGGACCGGTGACATTAACAA-3’P2：5’-GAATTCCCGGGGATCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTATACG-3’以金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)提取的基因组DNA为模板，用合成的P1、P2引物PCR扩增crtm的启动子及crtm和crtn基因，PCR反应体系均为50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 3min，30个循环，72℃ 10min，4℃ 10min。回收扩增产物。1.2 pMK3-crtmn质粒的构建用限制性内切酶HindIII和BamHI将pMK3质粒线性化。反应条件为HindIII和BamHI各2ul，10×buffer 4ul，pMK3质粒1ug(4ul)，超纯水28ul，37℃ 2小时。将酶切产物回收得到线性化的pMK3质粒。将线性化的pMK3质粒与P1，P2引物的扩增产物按照连接试剂盒(ClonExpressTM II One Step Cloning Kit)说明书进行连接，得到pMK3-crtmn质粒，酶切鉴定并测序。2.一种用权利要求1所述表达质粒电转化获得的能够表达C30类胡萝卜素的重组枯草芽孢杆菌。该重组枯草芽孢杆菌WB800菌株，属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。是由以下方法转化而成：取60μL枯草芽孢杆菌WB800电转化感受态细胞与1μ...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨倩，刘浩飞，徐文雯，朱立麒，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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