一种造血干细胞无血清培养基制造技术

本发明专利技术的目的在于提供一种造血干细胞无血清培养基，成分包括，细胞因子组合、DMEM培养液、胰岛素、转铁蛋白、BMP‑4、谷胱甘肽、FGF‑2和生长激素。所述细胞因子组合包括IL‑3，IL‑6，SCF和FL，浓度分别为：IL‑3：1‑20ng/ml；IL‑6：1‑100ng/ml；SCF：1‑100ng/ml；FL：1‑100ng/ml。通过研发无血清培养基、改变造血因子的加入顺序，解决目前造血干细胞培养基现有技术的弊端。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术的目的在于提供一种造血干细胞无血清培养基，成分包括，细胞因子组合、DMEM培养液、胰岛素、转铁蛋白、BMP?4、谷胱甘肽、FGF?2和生长激素。所述细胞因子组合包括IL?3，IL?6，SCF和FL，浓度分别为：IL?3：1?20ng/ml；IL?6：1?100ng/ml；SCF：1?100ng/ml；FL：1?100ng/ml。通过研发无血清培养基、改变造血因子的加入顺序，解决目前造血干细胞培养基现有技术的弊端。【专利说明】一种造血干细胞无血清培养基
本专利技术涉及生物领域，尤其涉及一种造血干细胞无血清培养基。
技术介绍
造血干细胞在体液循环中发挥关键作用：一方面，体液中各种血细胞都是由造血 干细胞分化而来；另一方面，体液中的血细胞更新和补充也依赖于造血干细胞的增值和分 化。随着个性化再生医学技术的兴起，造血干细胞在抗衰老及疾病治疗方面起着日益重要 的作用现在临床用于糖尿病、肿瘤、免疫系统疾病以及缺血性组织坏死的治疗，造血干细胞 移植也用于肿瘤放化疗后的支持治疗，以提高肿瘤治疗效果，降低复发率。 而造血干细胞培养如何实现快速扩增又不影响其功能是造血干细胞培养的关键， 然而现有技术中培养造血干细胞技术不够成熟，表现在细胞的增殖速度慢和传代次数较 低。 现有的干细胞培养基中添加了胎牛血清(FBS)和动物来源的生长因子。然而这些 动物来源的成分会在临床上引起很多潜在的危险：（1)含有的免疫原和毒蛋白能激发免疫 反应，发生免疫排斥，比如，体外培养带有动物来源Neu5GC抗体的细胞，移植到人体内后会 产生严重的免疫排斥反应。动物来源组分扩增的细胞一直到人体内后会引起严重的过敏反 应和免疫排斥反应；⑵增加了病原微生物污染干细胞的危险性，包括病毒和细菌感染、朊 病毒和未知的动物传染病;不利于干细胞的临床应用和基础研究。 造血干细胞的增值分化、发育成熟过程相当复杂，依赖于各种造血因子的调节，其 中细胞刺激因子发挥的作用极为关键。ΙΠ 型酪氨酸激酶受体配体(flt3-ligand FL)是最近 几年发现的一种调节早期造血的细胞因子，主要生物活性表现为刺激早期造血干细胞的增 值与分化。白细胞介素3(InterleUkin3 IL-3)有利于造血细胞的生长和活性维持，然而对 造血干细胞早期增值分化有抑制效应。 通过研发无血清培养基、改变造血因子的加入顺序，解决目前造血干细胞培养基 现有技术的弊端。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种无血清的造血干细胞培养基。 为实现本专利技术的目的，本专利技术提供了以下技术方案： -种造血干细胞无血清培养基，成分包括，细胞因子组合、DMEM培养液、胰岛素、转 铁蛋白、BMP-4、谷胱甘肽、FGF-2和生长激素。 所述细胞因子组合包括IL-3，IL-6，SCF和FL，浓度分别为：IL-3 l-20ng/ml; IL-6 l-100ng/ml；SCF l-100ng/ml；FL l-100ng/ml〇 转铁蛋白的浓度为0 · 05-0 · 15μg/ml; BMP-4的浓度为0 · 05-0 · 15ng/ml;所述多肽浓 度为100-300μg/ml;其特征在于所述FGF-2浓度为5-15ng/ml;所述生长激素浓度为1 -20ng/ ml 〇 胰岛素浓度为5-15μg/ml。 所述DMEM培养液为高糖型DMEM培养液，葡萄糖浓度为3000mg/L-4500mg/L。 所述的DMEM培养液包括以下组分:无水氯化钙、无水硫酸铜、九水硝酸铁、七水硫 酸亚铁、氯化钾、氯化镁、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、七水硫酸锌、 L-精氨酸盐酸盐、L-胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L- 亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、次黄嘌呤、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨 酸、L-天门冬酰胺、D-葡萄糖、L-天门冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-色 氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、亚油酸、硫辛酸、酚红、维生素 B12、l，4-丁二胺二盐酸盐、丙酮酸 钠、维生素 H、D-泛酸钙、氯化胆碱、胸苷、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆淳、核 黄素、盐酸硫胺。 所述的DMEM培养液各组分的浓度为： 无水氯化興 90- 120mg/L 无水硫酸铜 a 001-0, Θ02 mg/L 九水硝酸铁 0.03-0. 07 mg/L 七水硫酸亚铗 Q. 3-α· 5 rag/L 氯化钾 300-4QQ mg/L 氯化镁 卽-35 mg/L 无水硫酸镁 40-60 mg/L 氯化钠 8000 fflg/L 无水磷酸二氢钠 热-55. m_g/L. 磷酸氢二钠 63-80 .mg/L 七水硫酸锌 0. 4-0. 5: mg/L L-精氨酸盐酸盐 100-200 mg/L L-胱氨酸盐酸盐 20-4(3 mg/L L-谷氨酰胺 30:0-姐0 mg/.L 甘氨酸 10-3? mg/L L-亮氨酸 《-60 fflg/L L-赖氨酸盐酸盐 80-100. mg/L L-蛋氨酸 l5-.22:mg./L 次黄嘌呤 卜3 mg/L L-苯丙氨酸 30-40 mg/L L-丝氨酸 2:0-30 mg/L L-苏氨酸 40-60 mg/L L-丙_ 氛酸 _3-& mg/L L_天门冬酰胺 ：5-1Θ mg/L D-葡萄糖 300:0-450:0 mg/L L-天门冬氨酸 5-7 mg:/L L-半胱氨酸盐酸盐 10-20. mg/L L-谷氨酸 5_:9_ mg/L L-脯氨酸 15-20 mg/L L-色氨酸 ：8-1_Q :mg/L L_ 酿氨酸 30-45. mg/L L_顯氣酸 45-55 m:g./L 亚油酸 0· 03-0. 05 mg/L 硫辛酸 0. 1-0. 15 mg/L 酚红 7-10 mg/L 维生素 B12 0. 5-lmg/L 1，4-丁二胺二盐酸盐 Ο. 05-0：. 1 mg/L： 丙酮酸钠 4:0-.60 mg/L 维生素 Η 0. 003-0, 04 mg/L D-泛酸钙 2-3 mg/L 氯化胆碱 7-9 mg/L 胸背 0, 3-0：. 4 trig/i, 叶酸 2:-4 _mg/L i-肌醇 m-20 mg/L 烟酰胺 1· 5-:2:, 5 rag:/L 盐酸吡哆醛 1-3: mg./L 盐酸吡哆淳 Θ, 02-0:, Θ4 mg/L 核黄素 （λ 1-0. 3 mg/L 盐酸硫胺 .1. 5-2. 5 mg/L。 -种造血干细胞无血清培养基的使用方法，培养造血干细胞过程如下:a、在制备 好DMEM培养液中按浓度加入胰岛素、转铁蛋白、BMP-4、谷胱甘肽、FGF-2和生长激素制作成 培养液;b、在24孔板中进行培养，每孔lml培养液，接种接种所需的造血干细胞，接种密度为 lX105cells/ml，于37°C、5%C02的全饱和湿度下培养;c、培养第一周加入IL-3+IL-6+SCF; 第7天同时加入FL直到第四周结束;第14d起停用IL-3。 补充说明 FL是(flt3-ligand)III型酪氨酸激酶受体配体； IL-3 是 Interleukin3 白细胞介素 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种造血干细胞无血清培养基，其特征在于：成分包括，细胞因子组合、DMEM培养液、胰岛素、转铁蛋白、BMP‑4、谷胱甘肽、FGF‑2和生长激素。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张严冬，谢海涛，李相鲁，孟建军，
申请(专利权)人：广东万海细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44